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海洋藻类是海洋初级生产力的主要贡献者,其种类繁多、分布广泛。海洋红藻富含琼脂糖、卡拉胶等多种多糖,广泛应用于农业、生物医药、食品、制药和能源行业等多个领域。海洋细菌在海洋藻类多糖的降解及循环中发挥重要作用。最近,海洋细菌降解红藻单糖主要组分——3,6-L-内醚半乳糖（L-AHG）的代谢途径被报道。但是,关于海洋细菌利用L-AHG的分子机制还不清楚。本文中,我们系统研究了海洋弧菌Vibrio variabilis JMC19239中L-AHG代谢途径中的关键酶3,6-L-内醚半乳糖脱氢酶（VvAHGD）催化代谢途径中第一步反应的机制。通过生化、结构和突变分析,阐明了醛类脱氢酶VvAHGD氧化L-AHG的分子机制。通过序列、结构以及酶动力学参数的比较分析,表明VvAHGD及其同源蛋白是醛类脱氢酶（ALDH）超家族的一个新家族,我们将其命名为L-AHGDH家族。此外,我们还解析了海洋弧菌Vibrio sp.EJY3来源的3,6-脱水-L-半乳糖酸环化异构酶（VejACI）的晶体结构,其催化L-AHG代谢途径中的第二步反应。对VejACI的结构进行了初步分析。我们对海洋弧菌L-AHG降解途径中关键酶的研究,不仅有助于更好地了解海洋细菌在海洋藻类多糖的降解和循环中所起的作用,也为更好地实现藻类多糖在工业上尤其是生物燃料开发上的应用奠定了基础。一、3,6-脱水-L-半乳糖脱氢酶（VvAHGD）氧化L-AHG的分子机制研究通过序列搜索从海洋细菌Vibrio variabilis JMC19239的基因组中鉴定出一个可能编码3,6-L-内醚半乳糖脱氢酶的基因（VvAHGD）。随后我们对VvAHGD进行了异源表达和分离纯化,并测定了其基本酶学性质。VvAHGD能专一性地高效氧化L-AHG,偏好使用NADP+作为辅因子。VvAHGD的最适反应温度和最适pH分别为40℃和7.0。VvAHGD在溶液中形成稳定的二聚体。由于缺少相关的结构信息,VvAHGD氧化L-AHG的分子机制目前还不清楚。为了阐明VvAHGD的催化机制,我们解析了 VvAHGD和VvAHGD-NADP+复合物的晶体结构,分辨率分别为2.70 （?）和2.37 （?）,并通过分子对接的方法模拟了 VvAHGD-NADP+复合物结合底物L-AHG的结构。结构上,VvAHGD单体包括三个结构域:一个催化结构域、一个辅因子结合结构域和一个寡聚结构域。通过结构分析、突变和生化分析,确定了 VvAHGD的辅因子通道和底物通道,并确定了参与NADP+和L-AHG结合及催化过程中的关键残基。对VvAHGD及其复合物VvAHGD-NADP+进行比较结构分析表明,关键催化残基Cys282和Glu248在NADP+分子结合前后有明显的构象变化,这一构象变化在VvAHGD的催化过程中发挥至关重要的作用。VvAHGD通过其两个催化残基Cys282和Glu248的构象变化来控制辅因子通道和底物通道的不断连接和中断来进行催化,根据我们的研究结果,我们提出了 VvAHGD催化L-AHG氧化的分子机制。二、VvAHGD及其同源蛋白代表了一个醛类脱氢酶新家族VvAHGD属于醛类脱氢酶（ALDH）超家族。尽管VvAHGD在序列和结构上与已知的ALDH很相似,但是VvAHGD却表现出显著不同的底物偏好性。AHGD识别底物的分子机制目前还不清楚。系统发育分析表明,VvAHGD及其同源序列在ALDH超家族中形成一个独立的分支,并且不同的分支表现出不同的底物特异性。为了阐明VvAHGD识别底物的分子机制,我们对VvAHGD及其他ALDH的结构进行了详细的比较分析。通过对不同家族ALDH的辅因子结合通道和底物结合通道进行比较分析表明,辅因子通道在不同家族ALDH中都很保守,并且我们还找到了可能影响ALDH所结合的辅因子特异性的两个关键氨基酸残基。不同于辅因子通道,不同家族ALDH的底物通道差异很大。底物通道在形状、大小、表面电荷和氨基酸残基组成方面上的差异导致了 VvAHGD对底物的选择性不同于其他ALDHs。并且通过检测VvAHGD对不同醛类底物的动力学参数,进一步证实了我们的这一推测。由于VvAHGD（及其同源蛋白）在序列、结构以及底物选择性方面与已报道的ALDH的显著差异,以及其在进化树上的独立成簇,我们认为3,6-L-内醚半乳糖脱氢酶代表了 ALDH超家族中一个新家族,将其命名为L-AHGDH家族。三、3,6-脱水-L-半乳糖酸环化异构酶（VejACI）的结构分析海洋细菌Vibrio sp.EJY3来源的3,6-脱水-L-半乳糖酸环化异构酶（VejACI）催化L-AHG降解通路中的第二步反应。序列分析表明VejACI是一类环化异构酶,属于烯醇化酶超家族中的扁桃酸消旋酶亚家族。由于目前VejACI的催化机制还不清楚,为了进一步了解VejACI的催化机制,我们对VejACI进行了异源表达及分离纯化。VejACI在溶液中形成稳定的二聚体。随后,我们对VejACI进行了蛋白结晶,并对其晶体结构进行了解析,分辨率为2.2 （?）。VejACI蛋白的单体包括两个结构域,一个桶状结构域和一个帽子结构域。VejACI在单体结构上与其他的烯醇化酶很相似。VejACI中,Lys169和His300残基分别起到催化酸/碱的作用。初步的结构分析表明,VejACI的活性位点不含有Mg2+、Ca2+等金属离子,这不同于已报道的烯醇化酶,已报道的烯醇化酶催化活性通常依赖于金属离子。关于VejACI活性是否依赖于金属离子,还有待进一步的生化验证。我们对VejACI的研究,为后续研究海洋细菌L-AHG降解途径中ACI的催化机制奠定了基础。