miR-23a-5p调控IL22BP、NLRP3对百草枯肺上皮间质转化和细胞焦亡的作用及机制研究

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背景:百草枯(Paraquat,PQ)一种联吡啶类强效除草剂,因其价格低廉在发展中国家广泛使用,每年大约有上千人死于PQ中毒。PQ中毒后主要积聚器官:肺脏和肾脏,其导致的不可逆性的急性进展性肺纤维化和急性肾衰竭是患者死亡的常见原因。上皮间质(epithelial-mesenchymal transition,EMT)转化和过度炎症反应是PQ中毒导致肺纤维化发展中的重要环节。在该过程中细胞从上皮形态转变为间质形态的过程被称为EMT,伴随相关指标包括黏附蛋白(Epithelia cadherin,E-cadherin)以及α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的改变,赋予细胞迁移和侵袭的能力。此外,PQ所致的肺纤维化过程中还伴随着过度炎症反应,导致细胞凋亡、细胞坏死和细胞焦亡;炎性小体是体内免疫反应的主要参与者。当外界刺激激活NLRP3炎性小体后,导致含有半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的活化,从而使得一些细胞因子如IL-18、IL-1β的激活和释放。通过前期转录组高通量测序研究分析PQ诱导肺纤维化中差异性表达的基因,并生信预测基因之间的潜在结合位点。发现有关免疫通路的基因中共有85种mRNA,597种miRNA差异性表达,其中白细胞介素22受体亚基2(interleukin 22 receptor subunit alpha 2,Il22ra2/IL22BP)上调表达倍数较高。IL22BP是Ⅱ类细胞因子受体家族的一个成员,在特发性肺动脉高压患者血浆中高表达。miR-23a-5p作为近年新发现的microRNA,在肝纤维化中表达上调,但其在百草枯中毒中的作用机制尚未见报道。NLRP3介导的细胞焦亡介导多种疾病的发生发展,如神经细胞损伤、急性肾损伤等。miRWalk网站预测miR-23a-5p IL22BP、NLRP3的结合位点,通过控制miR-23a-5p的表达和抑制,探索miR-23a-5p对IL22BP、NLRP3的调控作用及该调控对百草枯致肺纤维化过程的影响。目的:揭示PQ中毒所致的肺EMT和细胞焦亡过程中miRNA-mRNA的调控关系对,为PQ中毒所致的不可逆性的肺纤维化探寻潜在的治疗靶点。研究方法:1、20mg/Kg、30mg/Kg腹腔单次注射给药于C57/BL6小鼠构建PQ中毒所致肺纤维化模型,组织病理生理水平上我们选择HE染色、Masson染色,切片观察肺组织是否纤维化,模型是否构建成功。提取组织蛋白通过Western-Blot检验E-cadherin、IL22BP及α-SMA的表达变化,探索是否发生EMT改变。2、基因水平上用qRT-PCR方法检测相应蛋白指标和miR-23a-5p的表达情况。3、以一定范围的PQ浓度梯度,探索MLE-12细胞染毒所致EMT的最适浓度。细胞模型构建后,分别从蛋白水平检测IL22BP、NLRP3、E-cadherin、IL-18、α-SMA、IL-1β、caspase-1在染毒组中的表达改变;qRT-PCR的方法探明MLE-12染毒模型中IL22BP、miR-23a-5p、E-cadherin、α-SMA的转录变化。4、转染miR-23a-5p的mimic、inhibitor,转染72h后,qRT-PCR和Western blot方法检验改变miR-23a-5p后MLE-12染毒模型中的E-cadherin、α-SMA及IL22BP、NLRP3、IL-18、IL-1β、caspase-1的表达。5、双荧光素酶实验验证miR-23a-5p和IL22BP结合,构建含有荧光素酶的IL22BP野生型和突变型质粒载体后,细胞内共转染miR-23a-5p,根据荧光素酶值判断两者是否结合。结果:组织病理切片结果显示,PQ组出现纤维化表现:肺间质水肿,炎性浸润,胶原蛋白增加;q PCR结果显示染毒组miR-23a-5p、E-cadherin基因转录水平显著降低,α-SMA、IL22BP转录水平升高;这些指标变化趋势与WB结果相同。体外细胞模型构建显示,随着PQ浓度的增加NLRP3、IL-18、IL-1β、caspase-1、α-SMA、IL22BP蛋白表达水平相对增高,E-cadherin蛋白较未染毒组降低,这些结果证明PQ中毒后存在细胞焦亡和肺上皮间质转化,并随着PQ浓度的升高趋势逐渐加重。转染miR-23a-5p过表达片段后,WB结果显示IL22BP、NLRP3表达降低,细胞E-cadherin表达较未转染组相对升高,但表达量依然低于未加PQ的对照组,α-SMA表达水平低于未转染组,高于对照组;NLRP3、IL-18、IL-1β、caspase-1蛋白质表达水平下降,EMT、焦亡趋势减轻;转染miR-23a-5p抑制片段后,IL22BP、NLRP3蛋白质表达水平升高,E-caderin降低,α-SMA升高;焦亡相关指标NLRP3、IL-18、IL-1β、caspase-1蛋白质表达水平升高,EMT、焦亡趋势加重。双荧光素酶实验结果显示IL22BP野生型双荧光素的表达较突变组明显降低,表明IL22BP与miR-23a-5p之间存在结合位点。结论:本研究结果证实IL22BP和NLRP3炎性小体参与百草枯中毒所致的肺上皮间质转化和细胞焦亡,并受miR-23a-5p调节。
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