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目的:急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是临床常见的疾病,AKI的发病率逐渐升高。严重的AKI往往导致肾功能和结构的不完全恢复,临床上表现出不同程度的慢性肾脏病(Chronickidneydisease,CKD)症状,称之为急性肾损伤-慢性肾脏病转化(AKI-CKD转化)。目前AKI-CKD转化的机制并不明确,既往的研究表明炎症细胞特别是巨噬细胞在这个过程中起到重要作用。NF-κB信号通路的经典通路即IKKβ通路在AKI后肾脏巨噬细胞的活化中起到促进作用,但非经典通路即IKKα通路在巨噬细胞活化中的意义并不明确。因此,第一部分的研究我们想探讨巨噬细胞中的IKKα在AKI后向CKD转换中的作用与机制。AKI-CKD转化过程目前并没有有效的治疗方法,骨髓间充质干细胞(BMSC)在器官损伤中有广泛的治疗前景,但BMSC因其易分化衰老的特点限制了其进一步的应用。第二部分的研究,我们设想可通过基因修饰的方法提高BMSC的治疗效果。方法:第一部分:利用Cre-loxp系统构建巨噬细胞中IKKα基因敲除小鼠(MacIKKα-/-)并鉴定敲除效果。以雄性8-12周龄小鼠为实验对象,采用血管夹夹闭左侧肾蒂45分钟建立肾脏缺血再灌注损伤(IRI)模型,将实验小鼠分两组:假手术(Sham)组与缺血再灌注损伤(IRI)组,这两组内再分别分为WT小鼠组及Mac-IKKα-/-小鼠组,设定IRI后第3天、7天、14天与21天四个观测点,每个观察点设6只小鼠,我们在这四个时间点收集血液与肾组织样本,并观察检测的各组小鼠肾脏的形态、重量以及血清肌酐、尿素氮水平。将收集的肾组织固定切片并行HE染色观察肾小管损伤,行Masson染色观察肾间质纤维化;利用免疫组化及Western blot观察检测纤维化相关蛋白的表达。通过诱导小鼠腹腔炎症细胞的产生,3天后提取腹腔炎症细胞后利用流式细胞仪检测Mac-IKKα-/-小鼠与WT小鼠腹腔炎症细胞中巨噬细胞的比例及其极化情况,用荧光显微镜检测肾组织中巨噬细胞的浸润及极化的情况。提取WT型小鼠的肾小管上皮细胞(TECs),使用氯化钴处理建立TECs的缺氧模型,将损伤后的TECs分别与IKKα-/-的巨噬细胞和WT巨噬细胞共培养,观察两种巨噬细胞对缺氧损伤TECs后EMT的影响和对Wnt/β-catenin通路的改变。第二部分:提取出WT小鼠的BMSC,并通过诱导分化以鉴定。使用GFP-Ad或Klotho-GFP-Ad 转染 BMSC,产生过表达 Klotho-GFP 的 BMSC(Klotho-GFP-BMSC)与其对照GFP-BMSC,通过荧光检测及Western blot检测转染后的Klotho的表达。使用CCK-8法检测3种BMSC的增殖能力,定量PCR检测干性基因OCT4与Nanog的表达。将小鼠分为4组每组8只,分别为Sham组、IRI组、IRI+GFP-BMSC组与IRI+Klotho-GFP-BMSC组。建立左侧肾脏IRI模型,建模后立即按分组肾包膜下注射转染后的BMSC。于IRI后第7天及第21天时收集血和肾组织,并观察检测的各组小鼠肾脏的形态、重量以及血清肌酐水平。将21天时肾组织病理切片行HE染色及Masson观察病理损伤程度及纤维化程度,行免疫组化染色及Western blot检测Wnt/β-catenin的表达变化;将7天时的肾组织冰冻切片后检测BMSC的浸润情况,免疫组化检测CD68+巨噬细胞的浸润。体外培养mCCD细胞并用TGF-β刺激建立EMT细胞模型,通过与2种BMSC共培养研究Klotho-GFP-BMSC对EMT的影响。结果:第一部分:我们建立的巨噬细胞IKKα基因特异性敲除小鼠模型,经过凝胶电泳及Western blot鉴定,巨噬细胞IKKα敲除成功。Mac-IKKα-/-小鼠有正常的肾功能和肾脏形态。与WT小鼠相比,Mac-IKKα-/-小鼠在IRI后21天内表现出肾功能及组织病理损伤的减轻。Mac-IKKα-/-小鼠肾组织提取的蛋白中EMT相关蛋白表达也低于相同时间点的WT小鼠肾脏。小鼠肾脏IRI后第3天及第7天,IKKα-/-小鼠肾组织有更少的M2型巨噬细胞浸润。我们提取出小鼠的腹腔炎症细胞后使用流式细胞仪分析发现,WT小鼠腹腔炎症细胞中巨噬细胞的比例要高于Mac-IKKα-/-小鼠,并且WT小鼠腹腔巨噬细胞中M2型巨噬细胞所占的比例要高于Mac-IKKα-/-小鼠。体外实验提示TECs受到缺氧刺激后EMT相关蛋白的表达会增高,WT巨噬细胞与其共培养可促进缺氧损伤TECs产生EMT,而IKKα-/-巨噬细胞无明显促EMT作用。第二部分:我们提取出小鼠BMSC并通过腺病毒转染成功构建Klotho-GFP-BMSC与GFP-BMSC。发现Klotho-GFP-BMSC的增殖能力增高,细胞内干性基因OCT4与Nanog的表达也上调。动物实验发现,与肾包膜下移植GFP-BMSC的小鼠相比,移植Klotho-GFP-BMSC的小鼠在IRI后21天有更好的肾功能及更轻的病理损伤,Wnt/β-catenin的表达相对更低;7天时肾组织中BMSC的数量更多而巨噬细胞的浸润减少。体外细胞共培养实验发现:与GFP-BMSC相比,Klotho-GFP-BMSC可以更加降低TGF-β诱导的mCCD细胞中α-SMA表达。结论:1、巨噬细胞参与了肾脏IRI后的修复过程;巨噬细胞IKKα基因敲除小鼠肾脏IRI后的纤维化过程明显受抑制;IKKα参与了巨噬细胞向M2型极化的过程;IKKα-/-巨噬细胞失去促进受损TECs发生EMT的作用。2、BMSC过表达Klotho后增殖能力提高,肾脏IRI后移植过表达Klotho的BMSC可明显减轻肾功能的下降及肾脏纤维化。过表达Klotho的BMSC与BMSC相比有更好的肾脏保护作用。