目的:电离辐射诱导的旁效应被定义为受照射细胞传递信号给周围未受照射的细胞从而导致后者出现的生物学变化。尽管旁效应的概念已被广泛接受,并且被认为可能在辐射致癌和放疗的疗效及副作用等方面发挥重要作用,但其发生的具体分子机制仍不明确。旁效应的产生需要两个细胞群,即受照细胞和未受照旁效应细胞。本课题的主要目的是从受照细胞的角度出发,来研究旁效应发生的分子机制并在构建的体系中探究旁效应的后果。首先在Ha Cat角质细胞中观察X射线是否能在同种细胞内诱导经培养液介导的旁效应,并对其可能机制做初步研究,在此工作的基础上,在以角质细胞Ha Cat和成纤维细胞WS1构建的二维培养模型中观察X射线和α粒子能否诱导旁效应的产生,研究旁效应的发生是否与射线品质相关,并进一步研究其相关机制,然后,对旁效应产生的后果进行研究,以细胞迁移能力为指标观察受照射角质细胞对未受照射角质细胞和成纤维细胞迁移能力的影响,最后,完成皮肤三维培养模型的初步构建,以期下一步在更接近机体正常环境的体系中研究旁效应。方法:首先采用条件培养液转移及二维共培养的方法,以微核(MN)、53BP1 foci、细胞增殖能力为生物学终点,检测X射线在角质细胞Ha Cat同种细胞中诱导经培养液介导的旁效应。用ELASA试剂盒检测条件培养液中TGF-β1的含量,用ROS试剂盒检测受到条件培养液培养后的未受照射角质细胞内ROS水平。然后采用二维共培养的方法,以MN形成为指标,观察角质细胞Ha Cat在分别经X射线、α粒子照射后能否在未受照射的成纤维细胞WS1中诱导旁效应的产生,探究该体系中旁效应的发生是否与射线品质有关。用TGF-β1受体激酶抑制剂SB431542抑制角质细胞Ha Cat内TGF-β1信号通路后,观察α粒子诱导的旁效应是否改变。用PCR检测受照射Ha Cat细胞内mi R-21的水平,然后观察经转染而过表达mi R-21水平的细胞受α粒子照射后诱导的旁效应MN是否发生变化,观察降低表达mi R-21水平的细胞是否能在与之共培养的WS1细胞中诱导类似旁效应MN的产生。用Western Blot检测经X射线或α粒子照射后的角质细胞Ha Cat内TGF-β1/Smad2信号通路激活情况,观察加入SB431542或者过表达该细胞mi R-21水平后是否降低α粒子诱导的Smad2的磷酸化水平,观察降低mi R-21表达水平后该通路的激活情况。用PCR检测经SB431542预处理再经α粒子照射后的Ha Cat细胞内mi R-21水平。观察经α粒子或X射线照射后的Ha Cat细胞内ROS的含量。采用同种细胞及异种细胞构建二维培养模型的方法,通过划痕实验观察受α粒子照射后的Ha Cat细胞分别对未受照射角质细胞及成纤维细胞的细胞迁移能力的影响。最后,以鼠尾胶原蛋白为基质,用角质细胞和成纤维细胞构建三维皮肤组织培养模型。结果:1、相对于相应对照组,经3 h条件培养液培养24 h及48 h后未受照射Ha Cat细胞MN形成率分别增加了28%和58%;经该条件培养液培养1 h后,未受照射Ha Cat细胞53BP1 foci阳性细胞率增加了44%;经该条件培养液培养24 h、48 h和72 h后,未受照射Ha Cat细胞的细胞增殖能力无明显变化。相对于新鲜培养液而言,3 h条件培养液中TGF-β1含量无明显变化。相对于新鲜培养液组,经3 h条件培养液培养1 h后,未受照射Ha Cat细胞内ROS水平增加了33%;但相对于相应对照组,经3 h条件培养液培养1 h后,未受照射Ha Cat细胞内ROS水平无明显变化。与受照细胞共培养48 h,未受照射Ha Cat细胞微核形成率增加了54%;与受照细胞共培养1 h,未受照射Ha Cat细胞53BP1 foci阳性细胞率增加了35%。2、I.在以角质细胞和成纤维细胞构建的二维培养模型中,以MN为指标,与对照组相比,发现未受照射的WS1细胞在与受到α粒子(0.56 Gy)照射的Ha Cat细胞共培养24 h后MN形成率增加了53%,而X射线(1、2、5、10 Gy)均不能诱导该现象的发生。但这种现象并非因为X射线造成的损伤小,事实上,2-10 Gy的X射线在Ha Cat细胞中造成的MN形成率和细胞致死率都高于0.56 Gy的α粒子。II.在该模型中,在照前用SB431542预处理Ha Cat细胞使得α粒子诱导的旁效应微核降至本底水平。III.α粒子(0.56 Gy)照射后Ha Cat细胞内Smad2磷酸化水平立即增高,于1 h达到高峰,并一直持续至少两个小时,而经X(1 Gy)射线照射后0 h、0.5 h、1 h、2 h Smad2磷酸化水平均无变化,加大X射线剂量至2、5、10 Gy同样不会增加Smad2磷酸化水平。IV.用10μM SB431542预处理Ha Cat细胞1 h,再用α粒子(0.56 Gy)照射,发现照射后1 h Smad2磷酸化水平在原有增加的基础上明显降低了。V.PCR结果显示信号细胞Ha Cat经α粒子(0.56 Gy)照射后1 h,mi R-21水平下降了1.6倍,3 h后mi R-21水平下降了1.2倍;经X射线(1 Gy)照射后1 h,mi R-21水平下降了1.4倍,3 h后却升高了1.7倍。在此结果基础上,过表达信号细胞中mi R-21使得α粒子诱导的旁效应MN降至本底水平,而仅仅降低信号细胞中mi R-21的表达就可以在与之共培养的WS1细胞中诱导类似旁效应的MN的产生。VI.信号细胞Ha Cat用10μM SB431542预处理1 h,再经0.56 Gyα粒子照射,照后1 h组mi R-21的下降水平由原来的1.6倍变为1.2倍,而3 h组则由原来的下降转为升高。VII.过表达Ha Cat信号细胞的mi R-21水平,再用0.56 Gyα粒子照射后,与相应对照组相比其Smad2的磷酸化水平降低。而当先降低Ha Cat信号细胞的mi R-21表达水平,发现与对照组相比,即使不加照射,也会激活TGF-β1/Smad2信号通路。VIII.α粒子(0.56 Gy)照射后5 h使得信号细胞内ROS水平增加了25%,X射线(1 Gy)照射使得细胞内ROS水平仅仅增加了3%。3、未受照射Ha Cat细胞在与受到α粒子(0.56 Gy)照射的Ha Cat细胞共培养24 h、48 h及72 h后细胞迁移能力明显增加,未受照射WS1细胞在与受到α粒子(0.56 Gy)照射的Ha Cat细胞共培养24 h、48 h及72 h后胞迁移能力明显减慢。4、成功完成了三维皮肤组织模型的构建。结论:1、X射线可以在角质细胞同种细胞间诱导旁效应的产生。2、在以角质细胞和成纤维细胞构建的二维培养模型中发现α粒子照射后可以诱导旁效应的产生,而X射线不能诱导旁效应的产生,显示旁效应的产生与射线品质相关。3、在异种细胞二维培养模型中,α粒子诱导的旁效应与受照Ha Cat细胞中TGF-β1/Smad2信号通路的激活和mi R-21的持续降低有关,并且TGF-β1/Smad2信号通路和mi R-21之间存在互相调控的作用。4、直接受照射角质细胞可以加快未受照射角质细胞的迁移速度,减慢未受受照射成纤维细胞的迁移速度。