论文部分内容阅读
目的：近年来，人们发现活化蛋白激酶C受体-1(receptor for activated protein kinaseC-1，RACK1)参与了多种肿瘤的调控。本研究旨在研究RACK1蛋白在大肠癌癌变过程中各个阶段的表达，通过建立稳定转染RACK1的结肠癌细胞株，及分析RACK1导入和敲除对结肠癌细胞生物学行为的研究，初步探讨RACK1表达与结肠癌发病的关系。方法：采用免疫组化方法检测RACK1在正常大肠粘膜组织、大肠炎性息肉组织、大肠腺瘤组织及大肠癌组织中的表达。采用Western blot检测正常结肠组织和结肠癌细胞（HCT116、HRT18、SW620、SW480和HT29）中RACK1蛋白的表达。在5株结肠癌细胞中筛选出一株RACK1高表达和一株RACK1低表达的细胞，采用脂质体介导的基因转染方法将RACK1表达质粒（PcDNA3-GFP-RACK1）及其空白质粒（PcDNA3-GFP）转染RACK1低表达的结肠癌细胞株，然后将RACK1干扰质粒（PSilencer3.1-RACK1）及其空白质粒（PSilencer3.1）转染RACK1高表达的结肠癌细胞株，采用Western blot检测转染后RACK1的表达水平、确定转染效果，建立稳定细胞系。MTT检测转染后细胞的血清非依赖性生长,流式细胞术检测转染后细胞的周期分布。结果:1、RACK1在大肠癌组织及细胞中的表达和临床意义免疫组织化学检测发现RACK1在23例正常大肠粘膜组织、20例大肠炎性息肉组织、20例大肠腺癌组织和92例大肠腺癌组织中的表达进行性上调(P<0.05)，在30例大肠高分化腺癌、30例大肠中分化腺癌和20例低分化腺癌中的RACK1表达水平逐渐降低(P<0.05)，分化程度越高的大肠腺癌组织中RACK1的表达越高(r=0.213，P=0.011)。RACK1的表达水平与大肠癌患者年龄、性别、淋巴结转移及Dukes分期没有相关性(P>0.05)。Western blot结果显示RACK1在结肠癌细胞株（HCT116、HRT18、SW620和HT29）中的表达高于正常大肠组织(P>0.05)。2、构建稳定转染的细胞系将RACK1表达质粒（PcDNA3-GFP-RACK1）及其空白质粒（PcDNA3-GFP）转入SW480细胞株，经G418筛选两周后，Western blot结果显示，以3号和34号克隆RACK1表达上调最明显(P<0.05)，后续试验均用这两株转染后的细胞作为实验对象；然后将RACK1干扰质粒（PSilencer3.1-RACK1）及其空白质粒（PSilencer3.1）转染HRT18细胞，G418筛选两周后，Western blot结果显示，以20号和30号克隆RACK1表达下调最明显(P<0.05)，后续试验均用这两株转染后的细胞作为实验对象。3、分析RACK1表达改变对结肠癌细胞生物学行为的影响MTT结果显示，SW480-3和SW480-34细胞与其空载体转染组和未转染组细胞相比，2天后开始生长明显增快（P<0.05）。HRT18-20和HRT18-30细胞同空载体转染组和未转染组细胞相比，3天后开始表现出较明显的抑制效应(P<0.05)。而流式细胞仪检测细胞周期显示RACK1表达升高，处于G0/G1期的细胞减少（P<0.05），S期的细胞增多（P<0.05）。结论：1、RACK1在大肠癌癌变过程中表达进行性上调，RACK1的表达水平与大肠腺癌的分化程度相关，提示RACK1参与了大肠癌的发生，在大肠癌中RACK1可能行使瘤基因功能。2、RACK1表达升高具有促进结肠癌细胞生长、影响细胞周期的作用