第一部分基于二代测序的中国人群急性髓系白血病基因突变模式及生物信息学分析研究背景急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是起源于髓系造血祖细胞的异质性恶性克隆性疾病,以骨髓和外周血中髓系原始细胞大量克隆增殖、抑制正常骨髓造血为特点。时至今日,化疗仍是治疗该病的主要手段,几十年来尚未取得重大突破。但是不同患者的临床病程和预后不同,对化疗的反应也不同。已有许多研究揭示了分子异常在AML中的作用和影响,并提出了精准医疗和个体化医疗的概念。目前,一些AML中常见的基因异常如FLT3内部串联重复(FLT3-ITD)已被加入危险度分层和预后判断的评价体系。在二代测序技术大规模应用的时代,研究基因突变及其在疾病中所起的作用对发展精准医疗和个体化医疗具有重要临床意义。目前已有多篇报道揭示了 AML患者中的重现性基因突变异常,一些被证明提示预后良好,一些被证明提示预后不良。然而更多关于体细胞突变与临床特征之间的关系及内在机制仍待深入研究。此外,中国人群AML患者的基因突变模式鲜见报道。研究目的为了向AML诊断和治疗提供更多信息和证据,对78例中国人群AML患者进行NCCN指南推荐的22个AML/MDS相关基因的靶向二代测序,旨在揭示基因型-表型演化关系,为精准医疗和个性化治疗提供理论依据和新药开发方向。研究方法1.患者标本78例于2016年2月至2017年10月期间在山东大学齐鲁医院接受治疗并做了二代测序基因突变检测的初诊和随访AML患者被纳入研究。根据法-美-英(FAB)分型,患者被划分为M1、M2、M3、M4、M5、M6和未分类。所有患者均已签署知情同意书。2.标本处理收集78例AML患者的骨髓标本,经过红细胞裂解液处理获得单个核细胞,使用天根基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。3.二代测序靶向22个基因的二代测序委托上海源奇公司借助Illumina公司HiSeq系统实施,平均测序深度2000×。文库由至少10μg基因组DNA构建。后续的序列拼接比对参考人类参考基因组GRCh37。该22个基因来自2015年NCCN指南推荐的MDS和AML相关基因突变。4.Sanger 测序通过二代测序发现的一些未报道的体细胞突变委托铂尚生物技术公司进行Sanger测序检验。针对突变区域设计特异性测序引物,然后进行聚合酶链式反应(PCR)。对PCR产物的一代测序由ABI PRISM 3730x1遗传分析仪器完成。后续基因序列可视化过程在SnapGene Viewer 3.2软件中进行。5.数据分析数据分析借助SPSS24.0软件完成。非正态分布的连续型变量由中位数(四分位数间距)表示。两组呈正态分布的的连续型变量的均值由独立样本t检验比较。非正态变量由非参数检验进行比较。对四格表资料由卡方检验或Fisher确切概率检验进行比较。单因素和多因素分析由线性回归和逻辑回归完成。生存分析做Kaplan-Meier分析和Cox回归分析。p值小于0.05认为有意义。6.生物信息学分析借助 mutationtaster、PolyPhen2、mutationassessor 和 SIFT 软件预测新发现的PHF6 H302R点突变对蛋白和疾病的影响。利用cBioportal在线软件制作基因突变模式图。利用cBioportal和UALCAN在线软件对TCGA公开的AML数据进行计算和图形绘制。基因突变和药物敏感性之间的关系通过检索查询GDSC数据库进行预测。研究结果1.中国人群AML患者基因突变谱特征78例AML患者平均年龄53岁,男性占56%,其中62例(80%)患者至少存在一个基因突变,突变频数为1-6。FLT3突变频率为26%,NRAS 17%,NPM115%,DNMT3A 和 IDH214%,ASXL112%,KIT、IDH1、TET2 和 U2AF19%,CEBPA 和 SRSF2 6%,EZH2 和 SF3B1 4%,TP53、SETBP1 和 ETV6 3%,RUNX1、PHF6、CBL和JAK2 1%。ZRSR2编码区未发现突变。检测到的突变包括点突变、插入/缺失突变,多数突变倾向发生于蛋白质结构重要结构域中。2.基因突变与临床和实验室指标之间的关系以60岁为分界线将患者划分为老年患者(>60岁)和中青年患者(<60岁),Fisher确切概率检验提示SRSF2突变与老年相关。在单因素分析中,伴有FLT3突变的患者显示出更高的骨髓原始细胞数、外周血原始细胞数、流式异常细胞比例和白细胞数。伴有TET2突变的患者显示出更高的外周血原始细胞数。在外周血原始细胞数和白细胞数的多因素分析中,FLT3和TET2都是危险因素。另外,TET2突变与首次化疗后未缓解(NR)相关。尽管伴有SRSF2突变的患者首次化疗后均为NR,但没有统计学差异。3.基因突变对临床预后的影响伴有三种或以上突变的患者总生存期较伴有少于三种突变的患者短。伴有表观调节基因(DNMT3A、TET2、ASXL1、IDH1/2、EZH2)突变的患者比不伴有这些突变的患者生存期短。伴有IDH1/2突变的患者比不伴有这些突变的患者生存期短。对全部AML人群,多因素分析显示FLT3-ITD、DNMT3A、IDH1、TET2和SRSF2突变是危险因素。对非M3患者,多因素分析显示FLT3-ITD、DNMT3A、IDH1和SRSF2突变是危险因素。对老年AML患者,多因素分析显示FLT3-ITD、DNMT3A和IDH1突变是危险因素。对细胞遗传学正常的AML患者,多因素分析显示FLT3-ITD、DNMT3A和IDH突变是危险因素。4.一代测序验证的新发现突变通过二代测序发现了 cosmic数据库和文献中未报道过的15种新突变,包括1种点突变PHF6H302R和14种插入/缺失突变。对其中6例插入/缺失突变标本进行Sanger测序验证,有5例检测到移码,有1例可能由于等位基因变异频率低(5.47%),低于Sanger测序检测阈值,因此未检测到移码。使用mutationtaster、PolyPhen2、mutationassessor和SIFT软件预测PHF6H302R点突变对蛋白和疾病的影响,结果均为致病/损害大/影响大/影响蛋白功能。5.中国人群AML和白种人突变模式的比较通过计算分析TCGA公开的白种人AML基因突变数据,发现基因突变谱与中国人群AML相似,但NRAS、ASXL1、SRSF2突变率较中国人群低,NPM1、DNMT3A、RUNX1突变率较中国人群高。6.基因突变与药物敏感性的关系通过检索GDSC数据库发现伴有个别基因突变的AML细胞系对一些药物或小分子化合物具有更高或更低的敏感性。结论1.80%患者至少存在一个基因突变,而其中近半数为只含一个突变。2.FLT3突变与TET2突变与外周血原始细胞数和白细胞数相关。3.TET2突变与第一周期化疗效果相关。4.FLT3-ITD、DNMT3A、IDH1、TET2和SRSF2突变是总生存期的危险因素。5.发现了 15个新突变类型。6.总结了白种人AML突变特征,并与中国人群AML突变特征进行了比较。7.总结了基因突变与药物敏感性之间的关系。第二部分Irf8在急性T淋巴细胞白血病中的作用和机制研究研究背景急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)是由基因突变引起的T系前体细胞恶性转化导致的造血系统恶性克隆性疾病。近年来,随着T-ALL治疗的进展,多数患者可获得完全缓解,但复发率仍然很高,长期生存率仅25-50%。因此,深入研究T-ALL的发病机制,寻找新的靶向治疗策略,不仅具有重要的科学意义,更具有潜在的临床应用价值。很多研究表明,Notch1突变是公认的T-ALL致病突变之一。Notch1是进化保守的内皮生长因子样跨膜受体蛋白(Notch)家族成员,其信号转导与细胞增殖、分化和凋亡密切相关。2004年有文献首次报道,超过50%的儿童及成人T-ALL患者存在Notch1激活突变现象,此后Notch1逐渐成为公认的T-ALL致癌基因。在淋巴细胞形成过程中,Notch1可促进T细胞的分化而抑制B细胞的分化,在T细胞形成与发展的多个阶段发挥作用。研究表明,选择性失活的Notch1信号通路可使T细胞增殖分化停滞,而Notch1基因突变可导致下游信号的持续激活,继而促进T-ALL的发生。关于白血病发生机制的“二次打击”学说认为,仅Notch1激活突变不足以导致白血病,仍需其他分子协同作用,共同导致T-ALL发生。干扰素调节因子8(Irf8)是干扰素调节因子家族中的一个转录因子,在调节造血系统谱系分化方面起重要作用。研究表明,Irf8促进粒系和B系细胞分化,而抑制单核-巨噬系和T系细胞分化。有报道显示,Irf8在髓系白血病中表达降低;在急性髓系白血病(AML)中发生剪接突变,野生型和突变型Irf8转录本表达增加与无复发生存率降低相关。还有报道显示Irf8在B系淋巴瘤不同亚型中存在表达差异,可作为一种新的诊断标志物。此外,多项研究显示,Irf8在鼻咽癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肾癌等多种癌症或其他疾病中发现甲基化水平改变,证明其本身是抑癌基因,由于异常甲基化导致其表达水平下调,起到致癌作用。另有报道,在调节性树突细胞中,Notch-RBP-J信号通路可通过MLL和PRC2等分子介导的组蛋白甲基化修饰使Irf8处于染色质折叠状态,抑制其表达水平。而在巨噬细胞中,RBP-J可促进Irf8蛋白合成。研究Irf8在T-ALL中的甲基化和基因表达水平及分子功能,有助于揭示Irf8和Notch1在T-ALL发生发展中的相互作用和机制,为T-ALL的诊治提供新思路。本研究发现,Ir8敲除小鼠的骨髓单个核细胞高表达Yes相关蛋白(YAP)分子。YAP是Hippo通路的重要成员,该通路参与器官发育、组织稳态和再生等重要生理过程。最近的研究表明,YAP作为一种癌蛋白,对大多数实体瘤的发生或生长至关重要,它的激活诱导癌症干细胞的特性维持、增殖、化疗耐药性和转移。而在白血病中,有报道显示,YAP在慢性髓性白血病(CML)细胞中过表达,抑制YAP的功能能够抑制CML细胞增殖,促进其凋亡。此外,YAP抑制剂维替泊芬可在体外增强伊马替尼的功效并抑制体内白血病的发生。但YAP在T-ALL中的表达水平和功能鲜见报道。由此提出科学假设:在共同淋系祖细胞水平由于Irf8异常甲基化导致其mRNA表达水平下调,进而抑制B系分化,促进T系细胞产生,协同Notch1使CLP转化为白血病起始细胞,并通过下游分子YAP促进白血病细胞干性维持或促进耐药,加速T-ALL发生和发展。研究目的研究Irf8协同Notch1激活促进T-ALL发生发展的作用及分子机制。研究方法1.生物信息学分析检索并计算分析oncomine数据库公开的T-ALL芯片数据,比较T-ALL患者与健康对照Irf8基因表达水平差异。利用MethPrimer在线网站分析Irf8启动子区域,预测CpG岛密集程度。2.细胞培养293T细胞系使用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养。病毒包装前一晚将状态良好的293T细胞按8×106-1×107/皿铺种直径10cm细胞培养皿。小鼠lin-细胞使用含15%胎牛血清的IMDM培养基培养。CCRF-CEM细胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养。293T细胞使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养。3.MSCV-Notch1-IRES-GFP 病毒包装扩增 MSCV-Notch1-IRES-GFP、pKat、VSVG 菌液,提取三种质粒,按照 7:5:3比例转染已铺皿的293T细胞,8h后换新鲜培养基,转染48h和72h分别收集培养基上清,经0.45μm滤器过滤,即为含MSCV-Notch1-IRES-GFP病毒颗粒的病毒液。4.体内验证敲除Irf8协同Notch1激活促进T-ALL发生发展常规饲养Irf8-/-和WT小鼠。提取Irf8-/-和WT小鼠骨髓细胞,lineage磁珠分选骨髓造血干/祖细胞(lin-细胞),加TPO、FLT3、SCF细胞因子过夜预刺激后加入MSCV-Notch1-IRES-GFP逆转录病毒液培养,8h后更换新鲜培养基,48h后荧光显微镜下观察荧光,流式检测GFP细胞比例,尾静脉注射经致死剂量照射的C57BL/6J小鼠,8周后小鼠逐渐发病。检测发病小鼠白血病相关指标,绘制生存曲线,验证敲除Irf8协同Notch1激活促进T-ALL发生发展。5.构建MSCV-Irf8-IRES-GFP逆转录病毒真核表达载体及病毒包装设计含有酶切位点的Irf8 CDS区特异性克隆引物,从含有Irf8 CDS区的普通质粒中克隆Irf8CDS区,插入MSCV-IRES-GFP载体,构建MSCV-Ir8-IRES-GFP真核表达载体。病毒包装过程同MSCV-Notch1-IRES-GFP。6.构建稳定表达Irf8的T-ALL细胞株MSCV-Irf8-IRES-GFP病毒液感染CCRF-CEM细胞,扩增,流式分选GFP阳性的细胞,即为稳定表达Irf8的CCRF-CEM细胞株。7.细胞增殖、周期及药物诱导的凋亡检测调整细胞密度种96孔板,CCK8法检测CCRF-CEM-GFP和CCRF-CEM-Ir8增殖速率差异。PI单染法检测细胞周期差异。AnnexinV-APC/7-AAD双染法检测药物诱导的凋亡率差异。8.YAP表达量检测收集Irf8-/-和WT小鼠骨髓单个核细胞、CCRF-CEM-GFP和CCRF-CEM-Irf8细胞,提取总RNA和总蛋白,RT-PCR和western blot检测YAP mRNA和蛋白表达水平差异。研究结果1.T-ALL患者Irf8表达情况通过检索oncomine数据库公开的T-ALL芯片数据,发现在4项不同的研究芯片中,与健康对照相比,Irf8均显示低表达。2.敲除Irf8协同Notch1突变促进T-ALL发生发展提取Irf8-8-和WT小鼠骨髓细胞,lineage磁珠分选骨髓造血干/祖细胞(lin-细胞),感染MSCV-Notch1-IRES-GFP逆转录病毒,尾静脉注射经致死剂量照射的C57BL/6J小鼠,8周后小鼠逐渐发病,检测到Irf8-/--Notch1小鼠较WT-Notch1小鼠生存期缩短,骨髓涂片和脾脏免疫组化显示白血病细胞处于更原始阶段,而两组小鼠在发病时的外观、血常规、体重增长率、脾脏大小无明显差别。3.T-ALL细胞系中过表达Irf8阻滞细胞周期,促进凋亡CCK8检测显示,过表达Irf8的CCRF-CEM细胞增殖减慢,流式细胞术检测显示,过表达Irf8的细胞周期阻滞,药物诱导的细胞凋亡增加,证明Irf8具有抑癌基因作用。4.Irf8负调控YAP通过检索GEO数据库公开的过表达或敲减Irf8芯片,筛选可能的下游靶基因。对Irf8-/-和WT小鼠骨髓单个核细胞进行western blot检测,发现YAP在Irf8-/-小鼠中显著高表达。而在CCRF-CEM-Irr8细胞中,PCR检测到YAP低表达。结论1.r8在T-ALL中表达水平降低。2.过表达Irf8的T-ALL细胞系增殖减慢,细胞周期阻滞,药物诱导的凋亡增加。3.I f8缺失能够协同Notch1激活突变加速T-ALL发生发展4.Irf8负调控癌蛋白YAP。