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目的:食管癌是来源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤,是临床常见的消化道肿瘤之一,在全世界的恶性肿瘤发病率中,食管癌居于第8位。在2012年约有45.6万食管癌新发病例,占全球恶性肿瘤病例的3%,食管癌居世界癌症死因第6位,2012年死亡病例约40万,占全球癌症死亡人数的5%。我国是食管癌最高发的国家之一,每年有超过22万例的食管癌新发病例,死亡约20万例[1]。目前,超过90%的食管癌患者确诊时已经进展到中晚期,生活质量低下,总体的5年生存率不到20%。随着现在科技的进步以及大量科研工作者的深入研究,对食管癌的认识虽然有了更深的了解,但提高我国食管癌诊治水平仍是艰巨而紧迫的研究难题。因此研究食管癌的发病机制,寻找食管癌的分子生物学早期诊断指标,探讨食管癌的靶向治疗,不仅在临床癌症诊治方面具有重要的价值,而且对于整个社会更有深远的积极意义。目前的一些研究发现,食管癌的发生发展与许多遗传学及表观遗传学的异常改变有关,但迄今为止,食管癌的发生发展的分子机制仍未被完全阐明,缺少有效的分子靶点及分子标志物来预测疗效。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA,广泛存在于人类基因组中,可通过不同方式影响编码基因的表达量和功能,对细胞的生物学进程起调控作用。母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）是目前发现长链非编码RNA中的一个,其主要表达于正常大脑、骨髓、乳腺、子宫、肺及胃肠道等组织中,而在多种恶性肿瘤组织中表达却明显减低乃至缺失[4-6]。有研究表明胃癌细胞中的MEG3表达水平显著下调,而过表达MEG3可明显抑制胃癌细胞的增殖[7]。但MEG3在食管癌中有何作用尚不明确。本研究旨在阐明lnc RNA MEG3在食管癌中的表达情况,探索MEG3表达水平的变化对体外食管癌细胞的影响,进一步为食管癌预后提供新的标志物,为食管癌的干预治疗提供新的靶点。方法:1食管癌组织及食管癌细胞系中的lnc RNA MEG3表达研究1.1收集32例手术治疗的食管癌患者的肿瘤组织及肿瘤旁正常食管组织,所有患者术前均未接受放化疗,术后病理确诊为食管癌,将切除的新鲜癌组织及对应的癌旁组织用PBS液清洗干净并放入液氮中速冻24小时,然后迅速移至-80℃冰箱保存。1.2 q RT-PCR检测肿瘤组织及瘤旁正常组织中MEG3表达:首先采用Trizol法提取肿瘤组织及正常组织的总RNA;然后利用凝胶电泳对RNA进行质量鉴定,确保RNA的完整性;设计lnc RNA MEG3的反转录的上、下游引物,参照Gene Bank所刊登的序列,使用引物设计软件primerprimer5对MEG3基因和GAPDH基因进行设计,以GAPDH作为对照;后进行反转录,q RT-PCR来检测细胞系内表达MEG3的表达情况。1.3购买食管癌细胞系Eca-109以及人正常食管上皮细胞系HEEC。1.4细胞培养:CO2 5%、37℃的孵箱。每12 d更换新鲜培养基,当细胞融合度达到80%90%时进行传代培养。1.5 qRT-PCR检测食管癌细胞系Eca-109以及人正常食管上皮细胞系HEEC中MEG3表达:应用Trizol方法提取总RNA;利用琼脂糖凝胶电泳进行对提取的RNA进行质量鉴定;最后应用q RT-PCR检测lnc RNA MEG3的表达情况。1.6统计学处理应用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析,计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验,计数资料以率表示,组间比较采用χ2检验,以P≤0.05则认为差异具有统计学意义。2 lnc RNA MEG3对食管癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。2.1细胞培养、引物合成及目的基因的合成方法同第一部分实验。2.2质粒构建首先根据设计的引物进行扩增,扩增结束后应用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,鉴定成功后构建真核表达载体pc DNA3.1-lnc RNA MEG3,构建完成后使用双酶切及琼脂糖凝胶电泳再次进行确定目的基因的真实性。使用空的pc DNA载体作为阴性对照组。2.3质粒转染所有用于转染的质粒载体（pc DNA-MEG3和空载体）经质粒提取试剂盒Midiprep提取重组质粒。按照使用说明书通过Fu GENE6转染试剂将pc DNA-MEG3或空载体转染至6孔平板上培养的细胞。48小时后检测结果。2.4 G418筛选细胞系首先确定抗生素G418筛选浓度,然后筛选出较稳定并且过表达lnc RNA MEG3的细胞系Eca109-p CDNA3.1-lnc RNA MEG3,并使用real-time PCR技术来检测目的基因表达水平,以确定细胞系是否已经建立成功,以转染空载体的阴性对照组及仅加入转染试剂的空白对照组作为对比。2.5细胞体外增殖实验使用MTT试剂盒并按其说明书对过表达的食管癌细胞系经行细胞增殖实验,来检测细胞的增殖能力,以转染空载体的对照组作为对比。2.6细胞体外侵袭实验利用Transwell小室实验对过表达的食管癌细胞系进行细胞侵袭能力的检测,以转染空载体的对照组作为对比。2.7细胞划痕运动实验对于过表达的食管癌细胞系通过划痕实验来检测细胞的迁移能力,以转染空载体的对照组作为对比。2.8 Western Blot实验将转染后的食管癌细胞裂解,获取细胞总蛋白,用考马斯亮蓝法测定细胞蛋白含量,取50μg行聚丙烯酰胺凝胶电泳,PVDF膜转膜并用脱脂奶粉封闭非特异性结合,然后依次孵育I抗及II抗最后用ECL显色液显影检测细胞中p53的表达,以GAPDH作为内参照,结果通过Image J进行灰度值分析。2.9统计学处理应用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析,,计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验,计数资料以率表示,组间比较采用χ2检验,以P≤0.05则认为差异具有统计学意义。结果:1食管癌组织及食管癌细胞系中的lnc RNA MEG3表达研究1.1 lncRNA MEG3在食管癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织。1.2 lnc RNA MEG3在食管癌细胞系Eca109中的表达明显低于人食管正常细胞系HEEC。2 lnc RNA MEG3对食管癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。2.1细胞体外增殖实验:上调MEG3的表达水平能降低食管癌细胞系Eca109的增殖能力。2.2细胞体外侵袭实验显示:过表达MEG3的食管癌细胞系Eca109的细胞穿膜数与对照组比较明显减少。2.3细胞划痕运动实验显示:过表达MEG3后的细胞间距较对照组明显增大。2.4 Western Blot实验显示:过表达MEG3的食管癌细胞系Eca109中的p53蛋白的表达较对照组显著增加。结论:1 lnc RNA MEG3在食管癌组织及细胞系中明显下调,提示其与肿瘤的发生有很大的关系,并且可能发挥抑癌基因的作用。2在食管癌细胞中过表达MEG3可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移运动能力,并且可能通过影响p53蛋白的表达发挥上述功能。