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背景:宫颈癌(cervical cancer,CC)拥有较高的发病率,占所有女性肿瘤的15%,位居第二。目前,宫颈癌出现新的情况,其出现新的上升、年轻化趋势。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路不仅在正常的细胞生长和增殖中起关键作用,而且影响肿瘤细胞的生长代谢、分化、增殖,甚至凋亡。其机制在于mTOR信号通路影响上游信号通路磷酸化的mTOR通路后,产生应答效应,调节其下游核糖体S6蛋白激酶(S6 kinase,S6K),从而调控m RNAs翻译转录。靶蛋白核糖体S6蛋白激酶(S6 kinase,S6K)是mTOR下游最具特色的蛋白之一,P70S6K的功能是使S6K磷酸化,促进蛋白质合成,抑制mTOR通路,阻滞G1期,导致细胞凋亡,以达到调控细胞增殖、生长的目的。肿瘤相较正常细胞,周期调控发生紊乱。研究发现,肿瘤与mTOR通路存在密切的关系,mTOR通路密切参与肿瘤细胞的周期、增殖、迁移、能量代谢和蛋白合成。Warburg曾经提出肿瘤代谢消耗大量的葡萄糖糖并产生大量乳酸,其产生的过程与丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)密切相关。文献证实,PK是调节能量代谢关键途径。其中,PKM2分为活性弱的二聚体,活跃的四聚体。二聚体在肿瘤细胞中伴随坏死和转移,可以释放入血中。文献已报道,mTOR和PKM2密切相关,上调PKM2的表达,导致Warburg效应。肿瘤上皮间质变(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)增加肿瘤的侵袭、转移。研究显示,TGF-β1可以诱导建立EMT模型,影响mTOR参与非Smad独立信号通路调控机制。二甲双胍作为糖尿病药物,其发挥作用是通过降低胰岛素抵抗和降低空腹血浆胰岛素水平。相比使用其他降糖药的患者,给与二甲双胍治疗二型糖尿病患者,更加不容易患癌症,并且可以降低多种肿瘤发病率,提高患者生存期。其抗肿瘤机制在于:通过激活AMPK通路,磷酸化结节性硬化症复合物2(Tuberous sclerosis complex gene2,TSC2)TSC2,形成TSC1/2复合体直接抑制mTOR通路,从而抑制下游p70s6k活性,影响蛋白质的转录和合成。目的:本课题为了验证宫颈癌上皮间质变下相关机制,使用TGF-β1诱导建立EMT模型,同时辅助添加有或无雷帕霉素阻滞mTOR通路,验证相关通路蛋白,从而证明存在mTOR通路机制,进而用二甲双胍验证mTOR通路机制。方法:本实验以宫颈癌Hela、Siha细胞作为研究对象,使用不同剂量的雷帕霉素阻滞mTOR通路,检测雷帕霉素对宫颈癌细胞生物学特性的影响及验证相关机制。第二步,实验构建EMT模型:不同浓度TGF-β1诱导宫颈癌细胞48-96小时,观测宫颈癌细胞形态及生物学特性,进而验证宫颈癌EMT和PKM2关系。第三步,在建立EMT细胞模型后,分别给予有或无雷帕霉素和TGF-β1处理宫颈癌细胞。检测EMT下,mTOR通路影响EMT细胞生物特性及其机制。第四步,分别给予有或无二甲双胍和TGF-β1处理宫颈癌细胞,验证mTOR/p70s6k/PKm2通路存在。具体实验方法:CCK-8检测细胞增殖;划痕测定迁移;流式仪检测凋亡;Western blot检测E-cadherin、STATA3、Snail2、vimentin、p-p70s6k和PKM2蛋白表达。结果:(1)雷帕霉素阻滞mTOR通路:雷帕霉素能够抑制Siha和Hela细胞的增殖,呈现剂量及时间依赖方式。在72 h时,25n M、50n M、100n M雷帕霉素具有明显统计学意义。在Hela细胞G0/G1期,细胞数目增加(50.8%至64%),S期细胞数目减少(40.2%至30.7%)。在Siha细胞,雷帕霉素导致细胞数目在G0/G1期(55.2%至70.7%)显著增加,而S期细胞数目从38.3%下降到24%。雷帕霉素剂量增加,Siha细胞细胞总凋亡细胞的百分比(早期凋亡+晚期凋亡)显著增加(0.8%至53.5%)。同样,Hela细胞中的凋亡细胞增多(0.1%至77%)。给予mTOR通路阻滞剂(雷帕霉素)后,影响其下游减少磷酸化p70S6K水平,从而下调PKM2表达。(2)建立宫颈癌EMT模型及检测与PKM2关系:给予TGF-β1处理细胞48h后,多数宫颈癌细胞发生上皮间质变表现为:上皮细胞极性消失,细胞间隙增大。CCK-8检测细胞活力显示:各浓度TGF-β1对Siha和Hela细胞的生长抑制率未发现减少,10ng/ml TGF-β1对细胞增殖有明显促进关系。体外划痕试验结果显示10ng/ml剂量组划痕间距较空白组明显变小。TGF-β1诱导EMT后,流式细胞仪结果凋亡明显减少。在Hela细胞中给予TGF-β1诱导后早期凋亡有0.1%下降为0.0%,总的凋亡由1.2%下降为0.1%。同样,Siha细胞TGF-β1诱导后早期凋亡有0.6%下降为0.4%,总的凋亡由1.4%下降为1.3%。TGF-β1处理48h,E-钙粘蛋白表达明显减少,波形蛋白表达明显增加。验证成功建立EMT模型。检测PKM2显示:诱导建立EMT后,PKM2明显增加。(3)提出宫颈癌上皮简质变下mTOR/70s6k/PKM2通路机制:TGF-β1可以诱导建立宫颈癌细胞上皮间质变,促进增殖和迁移。雷帕霉素能够逆转TGF-β1诱导的宫颈癌细胞上皮间质改变的细胞增殖和扭转TGF-β1诱导的EMT。TGF-β1处理细胞总凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)显著下降相比。50n M雷帕霉素处理组细胞凋亡率显著增加。此外,雷帕霉素的加入显著逆转了Hela和Siha细胞系中TGF-β1诱导的抗凋亡作用。Western blot结果:细胞给予TGF-β1作用后,减少E-cadherin表达,增加vimentin表达,而雷帕霉素组E-cadherin相对表达增加,而vimentin表达减少。此外,在TGF-β1诱导下,mTOR通路被激活,其下游磷酸化p70s6k表达增加,而雷帕霉素抑制mTOR通路,磷酸化P70S6K表达减少。此外,在EMT中,抑制mTOR通路同样降低PKM2表达。(4)验证宫颈癌上皮简质变下mTOR/70s6k/PKM2通路机制:二甲双胍呈现剂量依赖方式抑制Hela细胞的增殖。TGF-β1治疗在72h显著增加细胞,加二甲双胍可以减少宫颈癌增殖。Siha细胞有相似的效果。TGF-β1显著增加Hela细胞的迁移能力,二甲双胍逆转了TGF-β1引诱的迁移能力。类似,二甲双胍能够减少Hela细胞的迁移。另外,Siha细胞具有相同细胞迁移情况。TGF-β1处理细胞,Hela和Siha细胞,细胞的总凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)显著下降相比未经处理细胞。在给予10m M二甲双胍治疗细胞,细胞凋亡率显著增加。此外,二甲双胍显著逆转Hela和Siha两种细胞,TGF-β1诱导的抗凋亡作用。此外,二甲双胍的抗肿瘤效果,相似mTOR抑制剂抑制肿瘤效果。二甲双胍部分逆转TGF-β1建立的上皮间质变。Western blot研究显示:在Hela和Si Ha细胞中,TGF-β1显著诱导磷酸化的p70s6k。同时,TGF-β1显著增加PKM2中的表达。二甲双胍降低p-p70s6k和PKM2的表达。二甲双胍逆转TGF-β1诱导,降低p-p70s6k和PKM2的表达。结论:1、雷帕霉素能够抑制宫颈癌细胞增殖、迁移,诱导凋亡及阻滞细胞周期,涉及影响mTOR/P70S6K/PKM2通路机制。2、TGF-β1诱导建立宫颈癌EMT,其明显促进了细胞的增殖、迁移、抑制凋亡,并且证明上皮间质变(EMT)明显与PKM2密切相关。3、TGF-β1建立宫颈癌细胞上皮间质变,激活mTOR通路。给予mTOR通路抑制剂可以逆转TGF-β1诱导的上皮间质改变和减少mTOR/p70s6k信号表达,影响下调PKM2表达。4、验证药物二甲双胍逆转EMT,机制通过抑制mTOR/p70S6K/PKM2信号通路发挥抑制肿瘤作用。