钙依赖性蛋白激酶（calcium dependent protein kinase,CDPK）通过与Ca2+协同作用,参与调控植物生长发育并响应多种逆境胁迫,其C端调控区的EF-hand基序是使CDPK的激活依赖于Ca2+的关键结构。天山雪莲（Sasussured involucrata Kar.et Kir.）作为具有极强抗逆性的珍贵植物,对其抗逆基因功能及分子机制的研究具有重要意义。迄今,国内外对天山雪莲SikCDPK功能的研究非常有限,对SikCDPK1基因EF-hand基序及其响应非生物逆境的研究也较少。因此,本研究通过PCR定点突变技术对SikCDPK1中N、C端EF-hand基序分别进行定点突变(Ca2+结合位点),采用大肠杆菌表达系统进行体外诱导表达,使用镍柱亲和层析系统并结合超滤离心管分别对四种重组蛋白进行纯化、浓缩后,进行Ca2+结合能力及酶活性检测。另一方面,对两种不同生境植物SikCDPK1基因及GhCDPK1基因同时进行遗传转化,对比T1代转基因烟草在同一生长时期的生长发育表型差异,同时进行逆境胁迫处理,通过对表型差异及抗逆相关生理指标的对比观察,对SikCDPK1基因进行功能分析。主要研究结果如下:1、采用PCR定点突变技术,将SikCDPK1基因的第435位、471位、507位、540位氨基酸分别由E（谷氨酸）定点突变为Q（谷氨酰胺）,成功构建SikCDPK1基因不同位置EF-hand基序定点突变原核表达载体p ET32a-SikCDPK1-N-EF、p ET32a-SikCDPK1-C-EF、p ET32a-SikCDPK1-EFN+C、p ET32a-SikCDPK1,生物信息学分析发现,这些位点的突变会使得蛋白空间构象发生改变。转化表达菌株,四种重组菌株通过IPTG诱导均能够成功表达出目的重组蛋白,且重组蛋白可溶性表达较好的诱导培养条件是18℃1 mmol/L IPTG诱导16 h。通过镍柱亲和层析纯化及超滤离心管浓缩后,获得了纯度较好的四种重组蛋白,且电泳迁移率存在差异,表明获得的重组蛋白空间构象发生变化。2、对获得的重组蛋白进行Ca2+结合能力及酶活性检测,结果表明SikCDPK1与SikCDPK1-N-EF在Ca2+处理后,电泳迁移率变快,但SikCDPK1变化更明显,相比之下,SikCDPK1-C-EF与SikCDPK1-EFN+C在处理前后,电泳迁移率未表现出明显变化。说明SikCDPK1发生突变后,其Ca2+结合能力发生了改变。对激酶活性的检测发现,在EGTA存在的条件下,激酶活性均无明显变化,在Ca2+存在的条件下,SikCDPK1蛋白激酶活性被释放,随着时间的延长,其活性逐渐消失,突变蛋白SikCDPK1-N-EF及SikCDPK1-C-EF酶活性均出现不同程度的变化,突变蛋白SikCDPK1-EFN+C只在处理5min时出现较明显变化。以上结果说明不同位置的EF-hand基序对SikCDPK1空间构象及酶活性的影响不同,C端EF-hand可以结合Ca2+对空间构象产生影响,而N端EF-hand对激酶活性的影响较大。3、将SikCDPK1基因及GhCDPK1基因同时进行遗传转化,经表型对比观察发现,两种转基因烟草植株与野生型烟草植株相比均存在较明显的表型差异。转SikCDPK1基因烟草植株较高,叶片数量较多且叶片呈宽椭圆形,叶长较短,茎较细,而转GhCDPK1基因烟草植株与野生型烟草植株株高均明显低于转SikCDPK1基因烟草植株,转GhCDPK1基因烟草植株叶片数量较少但叶面积较大,呈长椭圆形,茎较粗。气孔观察发现,单位面积内两种转基因烟草植株叶片气孔数量均显著高于野生型烟草植株。4、通过对同一生长期的两种转基因烟草植株同时进行干旱及低温胁迫,发现转GhCDPK1基因烟草植株抗旱性强于转SikCDPK1基因烟草植株,而转SikCDPK1基因烟草植株抗寒性强于转GhCDPK1基因烟草植株,且在干旱胁迫复水后迅速恢复并出现开花迹象。虽然两种转基因烟草植株在抵御干旱与低温胁迫时存在一定差异,但其抗寒性及抗旱性均明显强于野生型烟草植株。相关抗逆生理指标的检测结果表明,转基因烟草植株能够在逆境胁迫下减轻细胞膜损伤,且渗透调节物质的大量增加被用于维持细胞内的渗透平衡,以进一步提高其抗逆性。