盐度是影响水生动物渗透压调节的重要环境因子,盐度的变化还会对生长、发育、免疫等生命活动产生一定的影响。日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)是我国传统的淡水经济养殖动物,该虾味道鲜美、营养丰富,是广大消费者喜爱的水产品之一。随着人民对水产品需求的不断增加,对海水品种进行低盐驯化、淡水品种进行盐水养殖,已经成为一些国家和地区的研究方向,对水产品进行盐度适应性研究具有非常重要的现实意义。本研究从盐度驯化对日本沼虾的渗透生理以及盐度养殖对日本沼虾生长的影响入手,首次探讨了盐度对日本沼虾生长生理的影响,以期为真正实现盐水养殖日本沼虾提供一定的理论基础。主要研究结果和结论如下:1盐度驯化对日本沼虾渗透压及离子浓度的影响在进行盐度养殖之前,对日本沼虾进行盐度驯化,通过逐步增盐的方法使其适应相应的盐度,驯化过程是日本沼虾调整渗透压适应盐度的过程。本研究设定四个盐度梯度,分别是淡水组(对照组)、盐度8、14、22,每日递增2盐度至所设盐度后适应一周,测定其血清渗透压和相应水环境渗透压,并对其血清中离子浓度进行测定。结果表明,血淋巴的渗透压与养殖环境的渗透压呈现出显著的线性关系,根据公式,推算出日本沼虾的等渗点为490mOsm/kgH_2O,达到等渗条件对应的水体盐度约为14.4。血清中Na离子和Cl离子的浓度变化趋势相似,都是随着盐度的升高,离子浓度升高,但都在盐度22组时,有较明显的降低的趋势,而盐度变化对K离子的离子浓度影响未出现显著性的差异。结果表明,日本沼虾的渗透压会随着盐度的升高而升高,在渗透压调节过程中Na离子和Cl离子发挥重要作用。2渗透压调节相关基因的克隆及在渗透压调节过程中的表达Na~ /K~ -ATPase(NKA)和碳酸酐酶(CA)是两种重要离子转运酶,在维持甲壳动物渗透压平衡中起到重要的调节作用。日本沼虾是一种可以生活在淡水和低盐水域的中国重要的经济虾类之一,但其盐度调节的分子机制尚不清楚。因此,本研究通过RACE克隆方法,得到了Na~ /K~ -ATPaseα亚基和CA基因的cDNA全长,并命名为Mnα-NKA和MnCA,GenBank登录号分别为MH378774和MH827971。Mnα-NKA全长3778bp,3030bp的开放阅读框编码1009个氨基酸,序列不含信号肽,含有八个跨膜domains,一个ATPbinding位点和一个磷酸化位点。MnCA全长为1407bp,930bp的开放阅读框编码309个氨基酸,含有信号肽序列,有一段保守的碳酸酐酶区域(SEHTIDGVRYPMELHMV)以及由三个组氨酸残基(His-116,His-118,His-141)组成的可以直接与锌离子结合的锌结合位点。BLAST比对分析表明,Mnα-NKA和MnCA与其余甲壳动物表现出较高的同源保守性,分别为90%以上以及76%以上。相对荧光定量PCR显示,Mnα-NKA和MnCA在广泛表达于日本沼虾各组织中,在肝胰腺和鳃组织中的表达量最高。经逐步增盐法驯化日本沼虾后,发现在日本沼虾鳃和肝胰腺组织中,Mnα-NKA的表达量随盐度升高而升高,MnCA的表达量在鳃中盐度组均显著高于对照组,在肝胰腺中盐度8与对照组无差异外,其余盐度组也显著高于对照组,并对Mnα-NKA和MnCA分别进行免疫组化和原位杂交的细胞定位发现,在鳃组织中有大量分布。3盐度养殖对日本沼虾生长及非特异免疫的影响当日本沼虾通过渗透压的调节已经适应了所处的盐度之后,如果继续对其盐度养殖,会对其生长产生什么样的影响?是否会对其造成氧化损伤影响其免疫功能?为了验证,本研究对日本沼虾在不同盐度(0、8、14、22)下养殖6周后,对其生长和抗氧化能力进行了研究。结果发现,日本沼虾在盐度14组具有较高的存活率、增重率及肝体比。盐度对其水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量产生了一定的影响,胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶均受到盐度不同程度影响,在盐度14组活性最高,适宜盐度可以激活EcR、CDA1以及CHS的表达,表明一定的盐度可以促进日本沼虾的生长,在盐度14下日本沼虾处于较好地生长状态。本文检测了日本沼虾肝胰腺中非特异免疫酶(AKP和ACP),以及抗氧化相关酶(SOD、CAT、GPX、GST)以及GSH和MDA含量的变化,并检测了抗氧化酶相关基因(SOD、CAT、GPX、GST)以及免疫通路中关键基因的影响,发现适宜的盐度可以提高日本沼虾的抗氧化能力和非特异免疫能力,但过高的盐度则会对其造成氧化损伤,甚至出现细胞凋亡。4等渗盐度下日本沼虾转录组学的研究适宜的盐度对日本沼虾的生长具有一定的促进作用,盐度对哪些信号通路产生了影响,因此本文对等渗盐度(14)下的日本沼虾进行了转录组学的研究。共得到35991条大于300bp的Unigene,共有733条基因在日本沼虾对照组和等渗组中具有显著差异,其中上调基因共有416条,下调基因共有317条,共有170条差异基因富集到了GO数据库的生物过程、细胞成分及分子功能三个部分,差异基因与KEGG数据库进行比对,仅有91条差异序列与KEGG数据库比对成功,具有显著差异的富集通路多为代谢通路,而代谢通路中,脂代谢通路富集的基因最多的是甘油磷脂和甘油酯代谢信号通路,说明等渗盐度对脂质的代谢影响较为明显,可能与其肝胰腺性腺的发育有关,为日本沼虾的盐度适应性研究提供了一定的理论基础。5盐度对日本沼虾代谢相关酶的影响以及AK的克隆和表达通过转录组学的数据得出,盐度对代谢通路的影响较为明显,因此本文对脂代谢和糖代谢过程中的关键酶进行了测定,结果发现盐度养殖对日本沼虾肝胰腺组织和肌肉组织中的糖代谢都产生了一定的影响,在等渗盐度下,由于机体不需要进行剧烈的渗透压调节,因此不需要动用体内的肝糖原和肌糖原产生较多的能量,盐度并未影响肌肉中甘油三酯的含量,但对肝胰腺中甘油三脂含量的影响较大。同时,我们克隆得到了日本沼虾能量代谢关键基因精氨酸激酶的两个亚型(MnAK2和MnAK3)的cDNA全长。MnAK2cDNA的全长为1541bp,开放阅读框1071bp,共编码356个氨基酸,GenBank号码为MN149533。MnAK3cDNA的全长为1576bp,GenBank号码为MN149534.1,1068bp的开放阅读框编码366个氨基酸。多序列比对分析发现日本沼虾AK与其余甲壳动物具有较高的同源性。组织特异性结果显示MnAK2和MnAK3在日本沼虾肝胰腺和肌肉中的表达量最高。MnAK2的表达随着盐度的升高而升高,MnAK3则在所有盐度组均显著升高,WB的结果显示AK蛋白在盐度14和22组上调表达,表明在AK可能在日本沼虾调节能量代谢过程具有重要作用。综合以上试验,本研究发现日本沼虾能够通过渗透压调节基因的表达及离子浓度的变化来适应盐度的驯化,并且经过长期的盐度养殖发现,低浓度的盐度对日本沼虾的生长具有一定的促进作用,日本沼虾体具有一定的盐度耐受性,为实现日本沼虾的盐水养殖奠定了一定的研究基础。