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目的:荷人肺腺癌A549细胞移植瘤裸鼠肿瘤内部注射编码人生长抑素2型受体基因的重组腺病毒Ad-hSSTr2a-IRES-HSV1-tk,进行99mTc-Octreotide显像研究,探讨hSSTr2报道基因显像的可行性。
方法:1.99mTc-Octreotide的标记及体外受体结合特性研究:采用直接标记法,标记物经Sep-PakC18反向色谱柱纯化,ITLC-SG快速薄层纸层析法测定放射化学纯度,分析标记物的稳定性。采用受体放射分析方法,99mTc-OC与细胞进行摄取实验、饱和结合实验、竞争抑制实验,研究不同时间条件下的摄取动力学,建立99mTc-OC对NCI-H446细胞的特异性饱和结合曲线,Scatchard作图,计算解离平衡常数Kd及最大结合容量Bmax。2.Ad-hSSTr2a-IRES-HSV1-tk体外感染A549及细胞摄取实验研究:Ad-hSSTr2a-IRES-HSV1-tk在不同的病毒感染复数MOI条件下体外感染A549细胞;从A549细胞中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应RT-PCR扩增hSSTr2基因;进行A549细胞与99mTc-Octreotide的摄取实验。3.显像和生物学分布的研究:(1)荷瘤裸鼠显像研究:3只荷A549肿瘤裸鼠左上肢皮下接种肿瘤内注射Ad-hSSTr2a-IRES-HSV1-tk,48小时后,尾静脉注射99mTc-Octreotide分别于1h、2h、4h、8h进行全身平面显像,图像处理采用感兴趣区ROI技术,计算不同时相肿瘤与对侧相应部位的放射性比值,未注射Ad-hSSTr2a-IRES-HSV1-tk的荷瘤裸鼠作为对照;(2)荷瘤裸鼠体内分布研究:取3只瘤内注射病毒的荷瘤裸鼠于注射示踪剂4h后处死,取感兴趣器官及肿瘤组织称重并测量放射性计数,计算各脏器及肿瘤的摄取比值;(3)正常小鼠体内生物学分布研究:正常昆明小鼠24只随机分为6组,分别于注射99mTc-Octreotide后15min、1h、2h、4h、6h、8h处死,取感兴趣器官称重并测量放射性计数,经时间衰减校正后计算每克组织的百分注射量(%ID/g)。结果:1.99mTc-Octreotide的标记及体外受体结合特性研究:标记率为76.3%,标记混合物经Sep-PakC18反向色谱柱纯化后,放射性化学纯度为91.8%;99mTc-Octreotide在室温放置6h后,应用快速薄层纸层析法测定其放射化学纯度仍高于85%;NCI-H446细胞对99mTc-OC的摄取在37℃时峰值为20.1%,峰时发生在120min,Scatchard作图提示,NCI-H446细胞膜上SSTR的Bmax为1.19×105分子/细胞,Kd为0.77nmol/L。2.Ad-hSSTr2a-IRES-HSV1-tk体外感染A549及细胞摄取实验研究:RT-PCR成功扩增出hSSTr2基因;摄取实验结果提示,随着MOI的上升,A549细胞摄取99mTc-Octreotide逐渐增加,当MOI=20时,摄取率最高为13.9%。3.显像和生物学分布的研究:(1)荷瘤裸鼠显像研究:注射后4h肿瘤部位的放射性浓聚最高,显像效果最佳,肿瘤与对侧相应部位放射性比值为4.156,4h对照裸鼠为1.914;(2)荷瘤裸鼠体内分布研究:肾脏的摄取最高,肿瘤的摄取高于除双肾以外的其它器官;T/NT摄取比显示肿瘤与肌肉,肿瘤与骨骼的摄取比值较高,分别为7.40和6.56,其次为肿瘤与心脏、肿瘤与血液,分别为4.77和4.55;(3)正常小鼠体内生物学分布研究:99mTc-Octreotide在血中清除迅速,主要通过泌尿系统排泄,部分通过肝脏及肠道排泄。
结论:采用直接法进行99mTc-Octreotide的标记,标记方法简单,标记物经纯化后放射化学纯度高,体外稳定性好;体外细胞摄取和RT-PCR均证实报道基因hSSTr2成功转导hSSTr2-的A549细胞;体内动物显像也证实报道基因hSSTr2成功转导A549肿瘤组织。本项研究提供了一种生长抑素hSSTr2报告基因显像的可行性方法,为监测共转染HSV1-tk治疗基因打下了基础。