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背景和目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是一种螺旋状、微需氧的革兰阴性杆菌，定植于人胃粘膜。1983年澳大利亚学者Warren和Marshall在人胃粘膜活检组织中首次分离到该菌。H.pylori被认为是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因子，并与胃腺癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤以及原发性胃非何杰金淋巴瘤相关。1994年WHO将H.pylori列为Ⅰ类致癌因子。全球约有超过一半的人口感染H.pylori，西方国家H.pylori的感染率为25-50％；发展中国家，儿童期H.pylori的感染率为60％左右，成人期可高达80—90％。虽然H.pylori感染可持续终身，但大部分感染者(80％)均为无症状的带菌者，只有10—20％的感染者可发生慢性胃炎和消化性溃疡，极少数的感染者(0.1—4％)则可发展为胃癌。目前认为除与宿主基因易感性、环境因素有关外，更重要的是H.pylori菌株的毒力差异对临床疾病严重程度的影响。目前，H.pylori的cag致病岛(cag pathogenicity island，cag PAI)受到研究者的重视。许多流行病学调查资料显示，cag PAI阳性的H.pylori感染与严重胃炎、消化性溃疡、萎缩性胃炎和胃癌的发生密切相关。现已明确，cag PAI编码一个Ⅳ型分泌系统，该Ⅳ型分泌系统具有两个功能：一、将CagA从H.pylori转运到宿主细胞中；二、诱导胃上皮细胞合成和分泌细胞因子如IL—8等。cag PAI中的cagM、cagT以及ORF13等基因所表达的蛋白被认为是组成Ⅳ型分泌系统的重要结构成分，缺失cagM、cagT或ORF13的突变株则不能将CagA转运至宿主细胞内，也不能诱导宿主细胞合成和分泌IL—8。ORF10编码的蛋白与Ⅳ型分泌系统的形成无关，而是作为引导CagA进入Ⅳ型分2004户斤歹，次掌硕士学位论文馨泌系统的通道，缺失ORF10的H Pylori突变株不能转运CagA，但仍能诱导胃上皮细胞合成和分泌细胞因子IL一8。由于cagA、cagM、cagT、O盯13和ORF10具有重要的功能，且在cagl叭l内的分布具有一定的问距，可能可以作为检测完整cagPAI的依据。为此，本实验用PCR方法分别检测了cagl上的cagA、cagM以及cagH上的cagT、oRF 13和oRF10基因，以了解胃癌高发区浙江省岱山县H Pylori cagI〕AI的分布并分析各基因与胃十二指肠疾病类型的关系及与杭州市H Pylori的差〔己少十。 材料和方法收集因胃部不适接受胃镜检查患者的胃粘膜标本，进行H.Pylori分离培养，其‘卜岱山县分离培养得到H. Pylori124株，患者中男性90例，女性34例，年龄16一71岁，平均42.7岁，经胃镜及病理检查确诊为慢性胃炎60例，消化性溃疡59例，胃腺癌5例;杭州市分离培养得到厅Pylori47株，患者中男性25例，女性22例，年龄24一67岁，立「均43.3岁，经胃镜及病理检查证实为’漫性胃炎41例，消化性溃疡6例。将患者胃粘膜组织研磨后涂布在ECY选择性培养基上，37℃微需氧(5%02，10%cOZ，85%N:)培养5天，选择有典型H Pylori菌落生长、快速尿素酶试验阳性、氧化酶试验阳性、革兰染色镜检为革兰阴性、形态呈螺杆状或飞鸟状者为H Pyl、i，进一步传代培养2天扩增细菌。用标准酚/氯仿抽提法提取HPylori的基因组DNA，根据文献报道的引物，进行PCR扩增，反应参数为95℃预变性3min，随后94OC305、56oC305、72oC455共30个循环，最后72oC延伸7min。用琼脂糖凝胶电泳法将PCR产物进行电泳以检测H. Pyzor川击床分离株cagA、eagM、eagT、ORF13和ORF10的阳性情况。实验结果采用才检验(SpSSll.5)，凡0.05认为具有统计学差异。 结果和讨论H刃zori cagA、eagM、eagT、oRF13和oRFlo的阳性率:岱111县分别为100.0%、82.3%、96.8%、94.4%和99.2%;杭州市分别为100.0%、93.6%、97.9%、957%和100%。岱山县cagA阳性的菌株中，82.3%可能具有完整cag PAI，完整cag队I在消化性溃疡、’净性胃炎和胃癌患者的检出率分别为84.7%、80.0%和80.0%;杭州市cagA阳性的菌株中，91 .5%的菌株可能有完整的cag PAI，完整cag PAI在消化性溃疡和慢性胃炎患者的检出率分别为1 00.0%、90.2%。cag PAI内单个基因在消化胜溃疡、’隆胜胃炎和胃癌的检出率:岱山县，cagA的检出率均为100.0%;cagM分别为84.7%、80.0%和80.0%;cagT分别为%.6%、%.7%和2004户亏j’次掌硕士学位论文嘟100.0%;ORF13分别为94.9%、95.0%和80.0%;O即10分别为100.0%、98.3%和100.0%。杭州市来自消化性溃疡患者的6株H Pylori中，各基因检出率均为100.0%;自慢性胃炎患者分离的H Pylori，cagM的阳性率为92.7%，cagT为97.6%，o好13为95.1%，ORF10为100.0%。cagA不能作为完整cag PAI存在的标志;cag pAI的完整性及对其中单个基因的检测都不能用来预测H Pylori相关的胃、十二指肠疾病的类型;岱11)县与杭州市相比，厅pylori eagA、eagM、eagT、O盯13和ORFlo的阳性率及可能有完整cag pAI的H刀lori的比例未见明显统计学差异。 结论浙江省胃癌高发区岱11一I县临床分离H州ori菌株，其cagA不能作为完整cag pA】存在的标志;cag PAI的完整性及对其中的单个基因的检测都不能用来预测H Pylori相关的胃、十一二指肠疾病的类型;来自胃癌高发区岱山县的HPylori?