论文部分内容阅读
牙鲆(Paralichthys olivaceus)隶属鲽形目，早期发育经历了一个典型的变态过程。胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)是调控鱼类发育和生长的关键因子，其主要通过与其受体(IGF-IR)结合激活细胞内信号通路而发挥生物学作用。目前甲状腺激素(TH)调控鲽形目鱼类变态的分子机制还很不清楚，关于IGF系统在牙鲆变态中的功能作用更未见报道。本论文应用Real-time PCR、Western blot和免疫组织化学相结合的方法建立了IGF-Ⅰ及其受体基因在牙鲆成体组织、胚胎发育和仔鱼变态中RNA和蛋白水平的表达图式，在此基础上，探讨了IGF-Ⅰ/IGF-IR系统在牙鲆发育变态中的潜在功能;并运用外源TH处理牙鲆仔鱼和胚胎细胞，通过在体和离体实验研究了TH对IGF-Ⅰ及受体基因表达的影响;同时采用基于热不对称PCR的染色体步移技术克隆得到牙鲆IGF-IR5调控区序列，分析了其潜在的转录因子结合位点，并初步验证了其启动子功能，旨在为深入研究IGF系统的表达调控，探讨TH-IGF系统在牙鲆变态中的作用关系，为进一步阐述鲽形目鱼类变态发育的生物学机理提供资料。其主要结果如下: 1 IGF-Ⅰ在牙鲆发育变态中的表达图式 IGF-Ⅰ是脊椎动物中熟知的促进细胞增殖与分化的肽类激素，其在牙鲆变态中的作用尚属首次研究。本文采用荧光Real-time PCR技术检测了IGF-Ⅰ mRNA在牙鲆成体组织、胚胎发育和仔鱼变态中的表达。结果显示，IGF-Ⅰ mRNA主要由成体肝脏合成，在所分析的其它10种肝外组织中都有表达。而且IGF-Ⅰ mRNA在牙鲆胚胎发育和仔鱼变态中各个时期均有转录，但其mRNA水平是发育阶段性调节的。IGF-Ⅰ mRNA在早期胚胎发育中仅有较低水平的转录，神经胚期以后其mRNA表达逐渐增加，在孵化后3d仔鱼中已达到刚受精时的133.4倍(P＜0.05)，有趣的是，与早期仔鱼(13d)相比，IGF-Ⅰ mRNA水平在变态即将开始的17d和眼睛刚开始移动的21 d仔鱼中又有明显的跃升，分别是受精卵中的177.8和184.2倍(P＜0.05);但在变态高峰期(29 d)却明显F调，且在变态后稚鱼中保持较低的表达水平。本研究还采用Western blot技术评价了IGF-Ⅰ蛋白在牙鲆仔鱼发育期间的表达水平，发现其与上述mRNA水平的表达图式较为相似。上述结果表明IGF-Ⅰ很可能是牙鲆变态的重要调节因子。 2两种IGF-Ⅰ受体在牙鲆发育变态中的表达图式 IGF-Ⅰ的生物学作用主要是通过与其特异膜受体IGF-IR结合而实现，因而有关IGF-IR的表达分析将有助于进一步阐述IGF-Ⅰ调控的发育过程。本研究采用Real-time PCR、Western blot和免疫组织化学定位相结合的方法详细分析了两种不同的IGF-Ⅰ受体在牙鲆成体组织、胚胎发育和仔鱼变态中的时空表达及组织定位。 研究结果表明IGF-IR-1和IGF-IR-2 mRNAs在牙鲆胚胎发育、仔鱼变态和不同组织中是广泛表达的，进一步反映了IGF-Ⅰ在调控鱼类发育中的多能性。尽管两种IGF-IR mRNAs在成体组织的空间分布上大体是重叠的，但二者在牙鲆胚胎发育和仔鱼变态中均展现了迥然不同的时间表达图式。IGF-IR-1 mRNA在早期胚胎发育中表达水平较低，从原肠期开始迅速上调;相反，从受精卵到原肠期阶段有相当高水平的IGF-IR-2转录本存在，但从神经胚期开始明显下调。值得注意的是，两种IGF-IR mRNAs在变态前表达量增加，在变态的起始阶段达到最高水平，但在变态期间二者呈现出相反的表达模式，IGF-IR-2 mRNA水平明显降低，而IGF-IR-1 mRNA在整个仔鱼变态期间均保持较高的水平。这种时期特异性的分化表达表明二者在鱼类早期发育中可能发挥不同的作用。 组织化学定位的结果表明，较高免疫活性的IGF-IR蛋白在与眼睛迁移相关的增殖皮肤、逐步发育成熟的肠以及渗透压调节器官鳃和肾脏中出现，进一步揭示IGF-Ⅰ系统参与了牙鲆仔鱼变态发育的调节。 3甲状腺激素对IGF-Ⅰ及其受体基因表达的影响 在哺乳动物中，TH与IGF系统是密切相关的。本研究运用外源的TH处理牙鲆变态前仔鱼发现，IGF-Ⅰ mRNA水平明显降低，且IGF-IR-2 mRNA水平也下调，相反，IGF-IR-1 mRNA水平则上调;而其抑制剂TU处理则上调了IGF-Ⅰ和IGF-IR-2mRNA的水平，却使IGF-IR-1 mRNA水平降低。在体外培养的牙鲆胚胎细胞中发现，在TH浓度0～200 nM范围内，低浓度时，胚胎细胞IGF-Ⅰ mRNA表达量无明显变化;当TH浓度为100，150，200 nM时，胚胎细胞IGF-Ⅰ mRNA表达量明显下调。两种IGF-IR mRNAs则展现了不同的表达图式。随TH浓度增加，胚胎细胞IGF-IR-1 mRNA转录产物不断增多，而用TH处理时IGF-IR-2 mRNA水平明显下调，但不同TH浓度之间差异不明显。 上述在体和离体实验的结果均表明牙鲆IGF-Ⅰ和两种IGF-Ⅰ受体基因在转录水平的表达是受甲状腺激素调节的，暗示IGF-Ⅰ系统可能是牙鲆变态中甲状腺激素作用的靶系统。而且，两种IGF-IRs基因的表达对甲状腺激素的响应不同，进一步反映了二者可能在牙鲆变态中存在功能上的差异。 4 IGF-IR基因5调控区克隆及启动子功能分析 为深入研究牙鲆IGF-IR基因的表达调控，本研究根据已知的IGF-IR基因5UTR序列设计引物，采用基因组步移技术成功克隆了一段936bp的牙鲆IGF-IR5调控区序列。经生物信息学分析发现，其5调控区有2处潜在的启动子区。搜索TRANSFAC数据库，找到93处最佳相互匹配的转录因子结合位点，其中AP1、AP2、C/EBP、p300、E2F、Sp1、ER、GR、PR、MyoD、c-myb、Oct-1、Brn2、SRY等是诱导牙鲆IGF-IR基因转录的可能作用因子。除调节GH—IGF-Ⅰ轴外，甲状腺激素可能还将通过影响这些转录因子而调节IGF-IR基因的表达。 本研究还在上述牙鲆IGF-IR基因5调控区序列两侧引入特异酶切位点，将该片段与pAcGFP1-1报告基因载体重组，构建了pAcGFP1-IR重组质粒。采用脂质体转染的方法，将pAcGFP1-IR重组质粒导入293细胞，在倒置荧光显微镜下检测到了绿色荧光蛋白的表达，初步证实克隆得到的牙鲆IGF-IR基因5调控区序列具有启动子的功能。