背景：应激指机体在受到体内外各种因素刺激后,出现以神经内分泌反应为主的全身非特异性反应。适当应激可增强机体对外界有害因素的抗御能力,但应激过强或时间过长,可导致机体生理功能紊乱甚至引发应激病。军事应激是在军事活动中产生的一种特殊的应激状态,是军人对军事活动的刺激产生的生理及心理的反应。军事应激已成为军队非战斗减员的主要原因之一。我国军事应激研究与外军相比还有一定的差距,军事应激损伤的防护体系还有待完善和健全。对军事应激与心血管功能改变特别是心律失常发生机制的研究报道尚少。需要构建一套完整的应对军事应激的预防策略。因此,本课题从军事作业现场及实验室模拟应激状态,研究探讨军事应激与心律失常的关系及预防。目的：本课题着重从军事作业现场探讨军事应激与心律失常的关系及其防治。通过对动态心电图对比分析,了解心律失常的发生率、种类及自主神经系统在心律失常发生中的作用；应用ELISA法测定急性应激豚鼠血清NE、AngⅡ、TNI水平;利用膜片钳记录技术在全细胞模式下,研究应激状态下,豚鼠心室肌细胞动作电位和相关离子通道的改变,揭示军事应激状态下心律失常发生的离子通道机制。并应用β受体阻滞剂美托洛尔对应激状态进行干预,探讨β受体阻滞剂在预防军事应激状态下心律失常发生的作用及细胞电生理机制。第一部分军事应激状态对我国现役军人心电的影响课题实施时间：2006.03-2009.12。方案：对某驻京部队在执行特殊任务或进行集中军事演练的103名现役军人进行动态心电图监测,作为应激组；同时对该部队在3个月内未参加重大集中军事训练的150名现役军人监测动态心电图,作为对照组,对两组态心电图进行分析比较,研究军事应激状态下,参训军人心电图变化,分析心律失常发生情况,HRV, TWA等电生理指标变化。所有动态心电图记录时间除1例为13h外,其余均为22 h-24 h,两组无统计学差异。结果：心律失常：应激组房早发生率为83.5%,低于对照组的90%,房早平均个数应激组为80.6±6.4个／人,对照组为24.1±11.6个／人；应激组中有9人发生短阵房速,占8.74%,对照组有3人发生短阵房速,占2%；室早的发生率应激组为36.9%,对照组为42.7%,平均室早个数应激组为823.5±64.4个,而对照组为59.4±41.8个；应激组发生短阵室速的有3人,对照组无；应激组有1人发生猝死。心率：应激组的平均心率为76.1±8.8次／分,对照组为69.2±6.3次／分；心率变异性(HRV)的研究表明：在HRV各项时域指标中,应激组RMSSD高于对照组,而其他几项指标PNN50、SDANN、SDNN、SDNNindex等均低于对照组(P<0.05)。T波电交替(TWA)：本研究选择清晨晨9：00左右连续60对窦性心律时TWA情况,结果显示：应激组TWA阳性率为65.10%,明显高于对照组的39.56%,而且时域值也较高,两组分别为205.6±7.4μV、167.7±8.3μV(P<0.01)。结论：1、应激状态下,参训军人房早、室早的发生率较平时减低,但严重程度增大；房速、室速发生率和严重程度均增加。应激是我国军人心律失常产生或／和加重的原因之一。2、应激状态下,参训军人植物神经平衡紊乱,HRV降低,易引发心律失常。3、应激状态下,参训军人TWA阳性率高于对照组,心肌细胞电活动不稳定,增加了诱发心律失常的危险性。军事应激与心律失常的发生有密切的关联。第二部分应激与心律失常机制的研究方法：应用声光复合刺激作为应激原,连续12h刺激豚鼠,制备急性应激模型。记录实验动物的心电图,并应用ELISA法检测急性应激状态下,豚鼠血清中去甲肾上腺素(NE)、血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)和肌钙蛋白Ⅰ(TNI)含量。采用酶解法急性分离豚鼠心室肌细胞,成功稳定的分离出形态、状况良好,耐钙的单个豚鼠心室肌细胞。建立膜片钳全细胞模式。应用Iso 1.0μmol/L为工具药,建立急性应激细胞模型。应用膜片钳记录技术在全细胞模式下记录应激状态下,豚鼠单个心室肌细胞AP及Ikr、Iks、Ikl等电流,分析应激引起心律失常的离子通道机制。结果：1豚鼠急性应激模型建立及豚鼠心室肌细胞的急性分离：刺激后豚鼠出现目光呆滞,毛质干枯和乍起,蜷缩于饲养笼角落,不停小声鸣叫,食量改变等应激反应。应激组豚鼠心率为420±19次／分,比对照组298±12次／分快。心律失常的比较：对照组在观察期间ECG未见心律失常出现；应激组中有66.7%(6／9)发生多种心律失常,但持续时间均不长。ELISA检测结果显示,应激状态下豚鼠血清NE、ANGⅡ和TNI的含量分别为965.76±18.92 pg/ml、98.18.±11.06pg/ml和2.71±0.32 ug／L,均显著高于对照组血清含量,后者分别为423.58±7.46pg/ml、35.87±2.69pg/ml和0.24±0.05 ug/L(P<0.01)。提示,在应激状态下,动物的心律失常的发生率明显增加,体内应激反应介质NE和NGII均显著增加,标志心肌损伤的TNI的含量升高。2应激对豚鼠单个心室肌细胞动作电位(AP)的影响：室温下约25℃时,在细胞池中采用灌流法局部给予Iso 1.0μmol/L和Iso1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L后,APD有所改变,但变化较小,无统计学差异。37℃时,Iso 1.0μmol/L使单个心室肌细胞APD显著缩短,其中使APD50从对照组的245.1±12.3ms缩短至207.6±9.4ms,而APD90由对照组的325.8±21.5ms缩短至277.3±15.7ms(P<0.01,n=10)。给予Iso 1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L后,APD的参数有所变化,但变化幅度较小,与对照组相比,无统计学差异。3 Iso对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流快激活成分(IKr)的影响：在25℃时Iso1.0μmol/L对尾电流(Ikr,tail)影响较小,而在37℃时,在Iso 1.0μmol/L使IKr,tail电流明显增加。其中在去极化至+70 mV时,Iso使IKr,tail的电流密度从40±3.4 pA/pF增加到83.4±6.7 pA/pF (P<0.01, n= 12),而同时灌流Iso 1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L后,IKr,tail的电流密度仅增加至49.1±2.9pA/pF,与对照组无显著性差异(P>0.05,n=10)。在应用Iso 1.0μmol/L后,电流在各个电位下均显著增加,且随着电位正移电流密度增加幅度相对更大,即Iso作用存在一定的电压依赖性,而同时灌流Iso 1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L后,IKr,tail的电流密度在各电位下虽有改变,但均较小。对通道的门控机制研究显示,Iso 1.0μmol/L使通道的半失活电压(V0.5)向超极化方向移动,从对照组的-47.5±7.2 pA／pF移至71.1±5.2pA/pF,但并不改变曲线斜率(k)。应用Iso1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L后,无论是V0.5还是k均变化不大；与对照组相比,应用Iso 1.0μmol/L后使快速失活后恢复的电流幅值增加,其恢复时间常数在各个测试电压下均缩短,其中使-30 mV的时间常数1.34±0.21 s缩短到0.52±0.08 s。应用Iso 1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L后,无论是恢复电流幅值还是恢复时间常数变化均不大。Iso1.0μmol/L及Iso1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L等药物对亿通道的整流特征影响不大。3 Iso对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流慢激活成分(IKs)的影响：37℃时,应用Iso1.0μmol/L后,IKs,step和IKs,tail电流密度明显增加。使IKs,step从92.3±10.2 pA/pF增加到173.1±16.2 pA/pF (P<0.01, n=10),使IKs,tail的电流密度从22.3±2.5 pA/pF增加到55.8±4.1 pA/pF(P<0.01, n=10).灌流Iso 1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L,IKs,tail电流变化幅度较小,分别为22.3±2.5 pA/pF和28.4±5.2 pA/pF (P>0.05,n=10)。从原始电流图可见,Iso对IKs,step的作用在去极化脉冲初期明显强于后期,即刺激在最初1s使增加电流幅值的程度明显高于刺激末(4s)时。由电流的Ⅰ-Ⅴ曲线可见,电流约在-20 mV被激活,随着刺激脉冲的正移,尾电流增加,且表现出明显的外向整流特征。应用Iso 1.0μmol/L后,电流在各个电位下均显著增加,且随着电位增加电流密度增加幅度相对更大,外向整流特征更加显著,其作用存在很强的电压依赖性。而同时灌流Iso 1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L后,IKs, tail的电流密度在各电位下也有增加,但增加的程度均较小对通道的门控机制研究显示：三组心肌细胞间IKs的稳态激活曲线无明显差异,V0.5和k无明显不同(P>0.05)。与对照组相比,Iso1.0μmol/L使通道灭活时间常数增加,且此增加效应随电压正移而加大,至-20 mV时,是灭活时间常数从475±35 ms延长到2015±76 ms (P<0.01, n=10), Iso1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L使时间常数增加至502±3 1ms,无显著差异；Iso1.0μmol/L使慢性失活后恢复电流密度在各个测试电压下有所增加,且随电压正移,增加幅度也随之加大,至+60 mV时,是恢复发电流密度从63.2±5.9pA/pF增加到180.2±13.4 pA/pF (P<0.01,n=10).4 Iso对豚鼠心室肌细胞内向整流钾电流(IK1)的影响：37℃下,在细胞池中采用灌流法局部给予Iso 1.0μmol/L和Iso1.0μmol/L+Met 1.0μmol/L,三组IK1电流密度在膜电位为-140 mV时分别为85.1±0.5 pA/pF.83.9±0.3 pA/pF和86.7±0.7 pA/pF,无显著性差异。Ⅰ-Ⅴ曲线显示三组之间的电压依赖性无显著区别。结论：1、Iso对豚鼠单个心室肌细胞的APD50和APD90均有缩短作用,其中对APD90作用较强。Iso对豚鼠心室肌单细胞APA和RP等参数无作用。2、Iso使豚鼠单个心室肌细胞的IKr,tail增加,且此作用存在电压依赖性特征。同时应用Iso+Met此增加作用被明显减弱。3、Iso对豚鼠单个心室肌细胞的IKr,tail的作用与温度有关,在室温下没有调控功能,而37℃时,其增加电流的作用才表现出来。此增加效应主要是通过减少通道的稳态失活和加速通道的失活后恢复而实现的。同时,Iso对IKr,tail的稳态激活、快速失活常数及其电压依赖性和整流特征影响不大。4、Iso使豚鼠单个心室肌细胞的IKs,step和IKs,tail均增加,且此作用存在电压依赖性特征。同时发现药物对IKs,tep的作用在去极化脉冲初期明显强于后期。5、Iso对IKs,tail的增加主要由于对延长了通道的灭活时间常数,对通道的慢失活后恢复也有促进作用,但对通道的稳态激活、稳态失活等参数影响不大。6、Iso对IK1基本无影响。