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烟草暴露是我国普遍存在的公共卫生问题,大量研究资料证实烟草暴露与多种疾病的发生发展密切相关。普遍认为可替宁可作为评估人体环境烟草暴露水平的特异性生物标志物,但目前的检测技术还很有限,主要依赖于操作复杂、成本高的色谱质谱联用技术。本研究在应用气相色谱质谱联用（GC-MS）法测定人群尿液可替宁含量,评估人群烟草暴露水平及被动吸烟影响的基础上,构建人群尿液可替宁灵敏快速的检测方法并进行初步验证,为广泛开展人群烟草暴露监测及其健康危害预警提供更为简便的实用技术,具有一定的公共卫生学意义。本研究工作主要包括以下内容:一、气相色谱质谱联用检测尿液可替宁方法的构建及应用目的:构建尿液可替宁气相色谱质谱联用法,优化检测条件,检测人群尿液样本中可替宁水平;探讨可替宁截断值作为环境烟草暴露指征的潜在应用价值以及对被动吸烟人群健康危害的预警。方法:采用随机抽样的方法,采集江苏淮安地区290份普通人群尿液,通过统一调查问卷分析研究对象的吸烟自我报告情况;尿液经液液萃取、氮吹富集等前处理后,采用气相色谱质谱联用法定量检测人群尿液可替宁水平;应用接受者操作特性曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）获取人群尿液可替宁截断值（cut-off value）,与吸烟自我报告对比分析,评估人群烟草暴露及被动吸烟水平。结果:尿液中可替宁的线性范围为5~1000 ng·m L-1（R2=0.997）,定性检出限（LOD）和定量检出限（LOQ）分别为3.54、11.80 ng·m L-1。可替宁的加标回收率为82.62%~116.51%,日内和日间精密度相对标准误差（RSD）分别为1.19%~5.69%、6.57%~7.97%。受检人群尿液可替宁含量为20.40（8.87,64.81）μg·g-1 Cr;ROC曲线分析得到人群吸烟可替宁截断值为73.06μg·g-1 Cr,灵敏度和特异度分别为0.93、0.93;与自我报告比较,发现被动吸烟者被误判为非吸烟者达6.93%。结论:GC-MS可以较好地定量检测人群尿液可替宁含量,客观反映人群烟草暴露水平;通过ROC曲线分析得到人群可替宁截断值为73.06μg·g-1 Cr,有效识别被动吸烟者。二、基于酶生物催化原理的可替宁快速检测方法比较目的:探索基于酶生物催化作用的可替宁检测方法,构建灵敏、快速、简便和实用的可替宁检测技术,简化样本前处理及实验室操作流程。方法:基于碱性磷酸酶（ALP）和辣根过氧化物酶（HRP）的催化信号放大作用,通过抗原抗体的特异性识别,利用化学发光、Au NRs刻蚀、TMB显色法以及免疫荧光等方法分别检测可替宁,分析比较各检测方法的可行性。结果:研究显示,构建的ALP-可替宁抗体偶联物无法识别可替宁抗原,因此采用HRP催化体系检测可替宁。对化学发光法、Au NRs刻蚀法、TMB显色法以及免疫荧光法等进行分析比较,其中化学发光法和免疫荧光法具有一定的可行性。进一步优化发现化学发光法检测限较高,而免疫荧光法线性良好。因此选择HRP催化免疫荧光的思路构建可替宁快速检测技术。结论:基于酶生物催化原理的多项检测技术应用于可替宁检测结果比较显示,构建HRP催化免疫荧光法检测可替宁具有实用价值,0-200 ng·m L-1范围内线性良好,基本参数可满足样本中低水平可替宁的检出需求。三、HRP催化免疫荧光可替宁检测方法的优化及初步应用目的:构建灵敏、快速、简便、实用的人群尿液可替宁含量检测方法,初步探究该方法的可行性及应用前景。方法:优化HRP催化免疫荧光检测尿液可替宁方法的关键反应条件,确定最佳可替宁-BSA抗原与可替宁抗体比例、HRP标记羊抗鼠二抗稀释比例、邻苯二胺（OPD）和过氧化氢（H2O2）浓度比例、HRP催化时间等;分别配制500、200、100、40、10、2、1 ng·m L-1浓度的标准曲线溶液,绘制标准曲线,同时评估方法特异性、回收率等指标;应用构建的HRP催化免疫荧光法测定尿液样本,并用GC-MS进行验证,比较两种方法的检测结果,评估HRP催化免疫荧光法的可行性及准确性。结果:结果显示最佳反应条件为:可替宁-BSA抗原与可替宁抗体浓度比10:5,HRP标记羊抗鼠二抗稀释比1:1000,邻苯二胺（OPD）和过氧化氢（H2O2）浓度比25m M:1.5m M,催化反应时间10min。标准曲线在0.5~250 ng·m L-1范围内线性良好,线性方程为Y=-0.223*X+1.096,相关系数R2为0.995,最低检出限为0.21 ng·m L-1。尼古丁代谢物可替宁衍生物交叉反应率为28%,提示方法特异性良好;方法回收率在96.98%~108.20%之间,RSD均小于10%。应用构建的HRP催化免疫荧光法检测尿液可替宁水平,并用GC-MS检测验证,结果趋势一致。结论:初步构建了灵敏、快速、简便、实用的HRP催化免疫荧光人群尿液可替宁含量检测方法;该方法结果准确性高,无需繁琐的样本前处理,可广泛应用于现场筛查,具有良好的潜在实用价值。综上,本研究构建的方法由于侧重点的不同,其适用范围也不同。GC-MS法更适用于实验室精确的定量化检测,用于研究量效关系;而免疫荧光法更适用于被动吸烟者的快速区分,且检测限低于目前已有的检测试剂盒,可用于现场快筛。