阿尔茨海默病(Alzheimersdisease，AD)是老年期常见的一类慢性、进行性神经退行性病变。AD病变过程由多种因素参与，目前被广泛讨论的AD发病机制包括:遗传因素、炎症和免疫异常反应、自由基的损伤作用、氧化应激，病毒感染、激素代谢紊乱等。也提出了一些AD发病假说，包括“胆碱能假说”，“Aβ假说”和“谷氨酸假说”等。针对不同的发病机制而制定的AD治疗策略主要分为两类:①改善AD病人的症状，优化其生活质量;②药物干预AD的发病及疾病进程，包括神经保护策略。　　“胆碱能假说”是较早被公认的AD学说，中枢胆碱能神经递质的缺失被认为是AD患者发病的主要原因。在治疗上，根据上述治疗策略①，通过提高脑内乙酰胆碱的水平可改善患者的认知失常症状。由于大脑中主要参与学习记忆和认知功能的M1胆碱能受体的数目和功能在整个AD病程中变化不大，因此应用M受体激动剂直接作用于胆碱能神经突触后膜的M1受体加强拟胆碱功能，成为治疗策略①的优化策略。根据日常生活能力标准判断，一些先后进入临床试验的M1受体激动剂可以有效改善AD患者的认知功能和动作行为能力。　　“Aβ假说”和“谷氨酸假说”是根据AD的病理进程而提出的AD发病假说。这两种假说认为Aβ聚集成的老年斑或者谷氨酸过度激活NMDA受体均会引起神经毒性，从而造成神经元死亡和认知功能减退。因此在治疗上根据上述策略②，通过神经保护的方式干预AD病理进程而产生疗效。　　本研究所的研究方向之一为基于神经退行性疾病的小分子化合物的化学生物学研究。上世纪70年代，发现首个M-拟胆碱天然莨菪烷生物碱---包甲素[(2S，6S)2β-羟基-6β-乙酰氧基去甲莨菪烷]。以此为先导化合物合成了一系列包甲素类似物，并对其进行构效关系的研究。其中(-)-Satropane((-)-3-paramethylbenzenesulfonyloxy-6-acetoxytropane)有强效的M受体激动作用，且与经典的M受体激动剂卡巴胆碱不同，具有较好的M1相对选择性，目前正在进行一类缩瞳新药的临床前研究。　　我们在文献研究中发现，激活Gq/11偶联的胆碱能M受体（如:M1，M3，M5受体）对细胞具有普遍的保护作用。而在AD的治疗中，M1受体激动剂不但可以直接补偿胆碱能功能，还可以控制病情发展，包括阻止Aβ的生成和毒性，降低tau蛋白的过度磷酸化等。因此，研究M受体介导的神经保护潜能，特别是M1受体介导的神经保护作用，有助于全面评价M1受体激动剂应用于AD患者的治疗。　　本论文旨在以我们正在研发的一类创新药物------M受体激动剂(-)-Satropane为研究对象，进一步证明M1受体激动剂应用于AD患者治疗时，可同时满足上述两个治疗策略，即直接提高中枢胆碱能功能，通过AD治疗策略①达到“治标”的作用;也可在谷氨酸兴奋性损伤和Aβ损伤中发挥神经保护功能，干预AD的病程，通过治疗策略②达到“治本”的目的。本论文还同时对(-)-Satropane抗谷氨酸损伤和抗Aβ损伤的神经保护作用机制展开了的深入研究。研究结果可为M受体激动剂应用于AD治疗提供进一步的基础理论依据。　　（一）(-)-Satropane抗谷氨酸损伤的神经保护作用及其机制　　1(-)-Satropane对PC12细胞及脑片谷氨酸损伤的保护作用　　首先建立了PC12细胞谷氨酸损伤模型，在此模型上，采用MTT法检测细胞活力，通过检测细胞培养上清中的LDH，判断细胞受损程度，采用Hoechst33258染色法检测细胞凋亡，综合评价(-)-Satropane抗谷氨酸损伤的神经保护作用。PC12细胞经0.01μmol·L-1(-)-Satropane预处理24小时，可增强细胞活力，减少由谷氨酸引起的LDH释放，明显抑制谷氨酸的细胞毒性。Hoechst染色后发现，(-)-Satropane预处理后凋亡细胞数目显著减少。通过皮层脑片谷氨酸损伤模型进一步肯定了药物的神经保护作用，预先给予1μmol·L-1(-)-Satropane能减少脑片组织损伤，提高组织存活率。　　2(-)-Satropane抗谷氨酸损伤的作用靶点　　从两方面考察了(-)-Satropane对谷氨酸兴奋性细胞毒的保护作用的靶点。通过RT-PCR法检测了PC12细胞上M1受体的表达，证实实验所采用的PC12细胞表达M1受体。采用药理学的手段，应用(-)-Satropane前加入M受体拮抗剂（阿托品）或者选择性M1受体拮抗剂（哌仑西平），则其抗谷氨酸毒性的保护作用可被拮抗剂所阻断。以上结果提示，M1受体介导了(-)-Satropane的保护作用。　　3(-)-Satropane抗谷氨酸损伤的作用机制　　3.1(-)-Satropane通过PKC-ERK1/2抑制谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡　　M1胆碱能受体是Gq/11偶联受体，M1受体激动剂能激活磷脂酶C，并导致PKC和ERK1/2的活化。(-)-Satropane通过M1受体可部分恢复由谷氨酸下调的PKC活性，并可通过PKC逆转由谷氨酸诱导下调的ERK1/2活性。为了更加明确PKC和ERK1/2在此过程中的作用，分别采用PKC抑制剂Chelerythrine和MEK抑制剂U0126，发现(-)-Satropane的保护作用可部分被阻断，说明PKC-ERK1/2通路介导了(-)-Satropane激活M1受体产生的抗谷氨酸损伤的保护作用。　　3.2(-)-Satropane保护PC12细胞抗谷氨酸损伤中对Wnt/β-catenin通路的影响　　Wnt/β-catenin信号通路在AD病变过程中发挥重要的作用。Wnt信号通路中的GSK-3β是M1受体的另一个重要下游靶分子。我们的研究发现在谷氨酸损伤的PC12细胞，GSK-3β蛋白被异常激活，进而抑制了β-catenin由胞浆向细胞核转移，降低β-catenin的转录活性，减少β-catenin下游靶基因的表达。(-)-Satropane作用于M1受体，增强GSK-3β的磷酸化，即降低GSK-3β的活性，逆转这一过程。免疫荧光和核质分离实验显示，(-)-Satropane的作用能使更多的β-catenin进入胞核，β-eatenin报告基因活性上调。Real-timePCR结果证实(-)-Satropane促进了β-catenin下游靶基因的转录。综上，(-)-Satropane可以通过抑制谷氨酸上调的GSK-3β的活性，促进Wnt/β-catenin信号途径中β-catenin的转录，而发挥其神经保护作用。　　（二）(-)-Satropane对Aβ诱导的神经毒性的保护作用及机制　　为了全面评价(-)-Satropane的神经保护作用，我们在原代培养的大鼠皮层神经元上考察(-)-Satropane抗Aβ毒性的保护作用。Aβ在体外具有神经毒性，其生成和聚集可以激活凋亡细胞死亡级联反应并导致细胞死亡。1μmol·L-1(-)-Satropane预处理24小时后，可以显著抑制Aβ25-35活化后的毒性片段所诱导的神经毒性，提高细胞存活率。其机制为:Aβ打破了抑制凋亡蛋白(Bcl-2)/凋亡前体蛋白(Bax)平衡，(-)-Satropane在转录和翻译水平上都可以通过上调Bcl-2和下调Bax而干预细胞的级联凋亡。　　综上，本课题采用自主合成的手性M受体激动剂(-)-Satropane，以经典的M受体激动剂卡巴胆碱为阳性对照，证实了M受体激动剂对神经细胞的保护作用，包括抗谷氨酸损伤和Aβ毒性。进一步对机制的研究中发现:谷氨酸损伤会导致MAPK途径中的ERK1/2活性下调，激活Wnt/β-catenin信号通路中的GSK-3β，抑制GSK-3β下游β-catenin的转录活性。(-)-Satropane通过M1受体激活PKC-ERK1/2，抑制过度活化的GSK-3β，促进β-catenin的转录，产生对抗谷氨酸损伤的保护作用。而(-)-Satropane对抗Aβ毒性的机制为:在转录和翻译水平上，上调Bcl-2和下调Bax而干预细胞的级联凋亡。　　M受体激动剂(-)-Satropane是研究所长期对具有M-拟胆碱作用的包甲素及其类似物开展系统研究基础上合成的新颖化学实体。本课题对其进行了神经保护作用，作用靶点及保护机制的研究，为(-)-Satropane化合物的活性及其机制提供系统的数据，有利于在此基础上进一步优化药物设计。目前，利用体外神经细胞培养的方法研究药物对神经元的保护作用，可以更好地阐明药物作用机制，寻找对疾病更为有效的药物。本课题在谷氨酸和Aβ体外细胞模型上的研究发现(-)-Satropane发挥神经保护作用的靶点为M1受体，这为M1受体激动剂应用于AD的治疗提供了新的理论支持------在补充AD病人脑内胆碱能缺失，改善患者症状的同时，也能干预AD的进程。此外，在机制的研究中发现，激活M1受体干预另一个潜在的AD药物靶点------GSK-3β。以改善胆碱能系统为基础，兼有其他靶点调节功能的M1受体激动剂，也许会对AD的治疗产生更好的疗效。