苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29菌株cyt2基因的克隆、表达及杀蚊活性测定

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Cyt蛋白是由苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis.subsp.Israelensis,Bti)在芽形成孢阶段产生的δ-内毒素组成。本研究根据己报道在NCBI上的cyt2B基因序列,设计特异引物对Bt LLP29菌株中总DNA进行PCR扩增,得到大小约为1,000bp的类似cyt2B基因,对该基因进行克隆、表达,确定了菌株中cyt2B基因的存在,以pGEX-KG为表达载体构建cyt2B基因的表达重组质粒,并对其杀蚊活性进行测定,从而试图探索Cyt2B蛋白的生物活性及其在菌株中的生物功能。   结果表明,经PCR扩增、克隆、测序,获得序列大小约为1,000bp的基因全序列,序列里包含两个ORF,大小分别为789 bp和117 bp,其中789bp编码约为262个氨基酸,与文献中Cyt2B蛋白的氨基酸大小一致。利用NCBI上的Blast在线软件进行比较,发现10个Bt cyt2B基因序列以及多个基因组片段,其中与己报道的cyt2Ba7,cyt2Ba8等5个基因全序列(包括原始基因片段)同源性达到98[%]。因此,判断克隆出来的基因序列为cyt2B基因。经SDS-PAGE验证诱导表达重组菌株,显示该蛋白大小约为30kD,确定该基因编码的蛋白为Cyt2B。取Cyt2B蛋白表达重组菌株对白蚊伊蚊和致倦库蚊进行毒性测试,与Bt LLP29菌株相比,该表达菌株并不显示杀蚊活性。
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