几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键连接的高聚多糖，是构成昆虫表皮的主要成分。几丁质脱乙酰基酶1（CDA1）能够催化几丁质产生氨基和乙酸，对昆虫的表皮的几丁质进行修饰，是潜在的农药靶标。虽然人们通过 RNA干扰确定了 CDA1的功能缺失会导致昆虫蜕皮不正常而死亡，但对其生化性质却知之甚少。课题组前期重组表达了全长家蚕CDA1和CDA7蛋白。本论文工作主要包括重组表达家蚕几丁质脱乙酰基酶1的催化域（BmCDA1-CAD），对其进行结晶条件筛选，并研究了全长BmCDA1和催化域的底物结合活性及催化活性。另外，也探索了利用大肠杆菌制备亚洲玉米螟CDA1（OfCDA1）双链RNA的方法。　　本论文研究工作主要包括：　　（1）构建了表达载体pPIC9-BmCDA1-CAD，在毕赤酵母中得到了BmCDA1-CAD的重组表达，产量为5 mg/L。发酵液经硫酸铵富集后，采用金属螯合层析分离纯化，经SDS-PAGE电泳和Western Blot验证得到电泳纯的目的蛋白，其实际分子量约为50 kD。　　（2）利用Hampton Research公司的晶体试剂盒进行了BmCDA1-CAD的结晶条件筛选。蛋白质的缓冲液为20 mM Bis-Tris，10 mM NaCl，pH7.0。初步筛选400个条件得到晶体能够生长的条件，即0.2 M硫酸铵，0.1 M BIS-TRIS pH6.5，25%w/v聚乙二醇3350。之后通过调整蛋白浓度，pH值及沉淀剂浓度优化了363个结晶条件，最终确定适于BmCDA1-CAD晶体的生长条件为：蛋白浓度为12 mg/ml，结晶缓冲液为0.2 M硫酸铵，0.1 M BIS-TRIS pH6.8，27%w/v聚乙二醇3350。　　（3）通过对比阴性对照BSA发现，对于α-几丁质底物，全长BmCDA1的特异性结合能力（40%）强于BmCDA1-CAD（33%）；对于β-几丁质底物，全长BmCDA1的特异性结合能力（53%）强于BmCDA1-CAD（32%）；对于胶体几丁质底物，全长BmCDA1（27%）有特异性结合，但是 BmCDA1-CAD（17%）没有特异性结合；对于壳聚糖底物，全长BmCDA1（16%）和BmCDA1-CAD（12%）都没有特异性结合。　　（4）课题组前期工作证明了利用荧光胺法、MBTH法和对硝基乙酰苯胺法（基于检测游离氨基的生成）无法检测到BmCDA7和全长BmCDA1的催化活性。因此，建立一种新的基于游离乙酸检测的方法。以65%乙酰化壳聚糖为底物，以ClCDA为阳性对照，利用微量乙酸检测试剂盒，成功检测到BmCDA7的脱乙酰基活性，但是全长BmCDA1和催化域未检测到催化活性。序列分析发现BmCDA7和BmCDA1-CAD的相似性为36%，均有催化所必须的氨基酸。同源建模发现BmCDA1-CAD有一个较长柔性LOOP掩盖催化口袋，推测此结构导致催化活性差异。因此将 BmCDA1-CAD的长 LOOP替换为BmCDA7的短LOOP。构建重组质粒pPIC9-BmCAD1/7，并将其电转获得重组表达菌株。通过Western Blot验证，目的蛋白BmCAD1/7得到了诱导表达。需要进一步优化发酵和分离条件，得到纯蛋白以探究LOOP结构对催化活性的影响。　　（5）构建dsRNA的表达载体L4440-OfCDA1，L4440-OfEcR，L4440-GFP，将其转化至大肠杆菌HT115中实现高效表达，产量分别为3 g/L，0.15 g/L和0.12 g/L。研究结果表明使用IPTG诱导产生dsRNA的最佳菌液浓度为OD600=0.3；dsRNA在65℃以下稳定存在，对DNase I和RNase A的降解也具有一定抗性。这些初步研究使饲喂昆虫以研究OfCDA1的生理功能简单易行，也为绿色农药的设计提供了新思路。