生物碱是一类含氮的碱性有机化合物,是许多中草药的有效成分,具有广泛的生理药理活性,但其中部分生物碱毒性大,因临床用药过量、误食、投毒等造成的剧毒生物碱中毒事件亦屡有发生。在中药不良反应事件中,由生物碱导致的中毒所占比重很大。然而,由于体内代谢等原因导致体液中生物碱含量低,检测困难。目前对于毒物及药物的毒性分析涵盖了从宏观到微观的各个角度,涉及范围从大体动物实验到体内小分子与药、毒物之间的相互作用。斑马鱼作为一种新型动物模型其胚胎发育过程在母体外进行,非常适用于胚胎发育毒性试验及神经生物学试验。脱氧核糖核酸(DNA)携带和表达了重要的生命遗传信息,主宰个体的生长、发育、遗传变异等一系列生命现象,许多药物、毒物小分子均可与DNA发生相互作用。小分子物质与DNA之间的相互作用研究对于认识某些疾病的致病机理和阐明毒物的致毒作用机制,以及探究DNA的功能和结构方面都具有重要意义。研究结果表明许多生物碱可以和DNA之间发生相互作用造成DNA损伤,当损伤不能正确、及时修复时可能导致基因的永久性改变,这是机体致癌、致畸、致突变的分子基础。本文围绕生物碱这一犯罪及临床中毒案例常见毒物开展实验。首先建立快速、灵敏的检测方法,用于中毒案例生物检材的分析,为毒物分析工作提供技术支持;其次,应用斑马鱼胚胎为模型,研究相关生物碱的胚胎发育毒性及心脏毒性;最后,以DNA为体内的靶目标,研究生物碱与DNA之间的相互作用,了解其作用方式、结合位点、结合力等信息,以期为生物碱类物质中毒案例的相关法医毒物分析工作提供一定的理论基础。主要内容如下:第一部分马钱子类生物碱检测方法的建立目的:分别应用银(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光体系、在线固相萃取-高效液相色谱法两种测定方法研究中药马钱中两种主要生物碱马钱子碱和士的宁的检测新方法。方法:化学发光法:采用正交试验设计优化了影响Ag(Ⅲ)配合物-鲁米诺化学发光体系信号强度的四个主要因素,分别建立了测定药物及生物样品中马钱碱和士的宁的方法。高效液相色谱法:分别优化了在线固相萃取和分离条件,实现了生物样品中马钱子碱和士的宁的同时测定。结果:结果发现,应用化学发光法测定两种生物碱时,发光信号相对强度在5.0×10-7 M~1.0×10-4 M(盐酸士的宁)和5.0×10-8 M~1×10-6 M(马钱子碱)范围内与其浓度呈良好的线性关系。在线固相萃取-高效液相色谱法测定线性范围为2.9×10-5 M~2.9×10-3 M(盐酸士的宁)和1.2×10-5M~2.5×10-3 M(马钱子碱)。结论:此两种检验方法快速、灵敏,可用于实际样品的测定,结果满意。第二部分生物碱类物质的细胞毒性及其与DNA之间的相互作用研究目的:分别研究了马钱子碱、士的宁、乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的生物学性质,包括体外细胞毒性试验和DNA加合实验。方法:采用MTT法研究了5种生物碱的细胞毒性,分别利用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和DNA溶解实验探讨了生物碱与DNA之间的作用方式。结果:马钱子碱、士的宁对非洲绿猴肾细胞具有一定毒性;三种乌头类生物碱可抑制大鼠心肌细胞的正常生长。5种生物碱均可以嵌插及静电方式与DNA发生结合。结论:5种生物碱均具有细胞毒性且在体外模拟条件下可与DNA发生结合。第三部分以斑马鱼胚胎为模型研究川乌药酒的毒性效应及作用机制目的:研究川乌药酒的毒性及其作用机制。方法:药酒染毒斑马鱼胚胎后,镜下观察其形态学变化,利用吖啶橙(AO)染色法、观察基因表达量的变化进行毒性机制研究。结果:川乌药酒可对斑马鱼胚胎产生明显的发育毒性及心脏毒性作用,药酒作用于斑马鱼后镜下观察到形态学的各种改变,出现心率的加快和心率不齐,且药酒可诱导斑马鱼细胞出现凋亡,川乌导致的心脏毒性作用与BMP4、NKX2.5和TBX5表达量的变化有关。结论:川乌药酒对斑马鱼胚胎具有发育毒性及心脏毒性作用。