论文部分内容阅读
细菌耐药性情况日益严峻，尤其是“超级细菌”的出现和流行，使得人们担心“后抗生素时代（无抗生素可用）”的到来。噬菌体早在抗生素发现之前就被发现并尝试应用于治疗细菌感染。然而，由于抗生素的使用，临床上运用噬菌体治疗细菌感染一直处于边缘地位。近年来，噬菌体用于细菌的防控又重新回到研究者们的视野。本课题以上海临床上分离得到的主要常见院内感染细菌——铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和肠球菌作为研究目标菌株，从全国13个省市采集可能含有噬菌体的土壤、各类粪便和污水等样本，分离针对这些细菌的噬菌体，初步建立了噬菌体库，包括铜绿假单胞菌噬菌体22株、肺炎克雷伯菌噬菌体1株、金黄色葡萄球菌噬菌体2株和肠球菌噬菌体2株。在此基础上，鉴定了1种新的属于Twortlikevirus群组但尚未分类的葡萄球菌噬菌体，命名为Staphylococcus phage JD007；鉴定了1种新的未分类的克雷伯菌肌尾科噬菌体，命名为Klebsiella phage JD001；对分离到的假单胞菌噬菌体——Pseudomonasphage JD024研究发现，其不携带有抗-CRISPR基因JBD5035和JBD5036，这为了解假单胞菌噬菌体进化演变等提供了线索；对该三株噬菌体的生物学特征进行了研究及全基因序列解析，发现它们均为烈性噬菌体，基因组上不携带有毒力或耐药基因；生理特性实验发现它们都具有较好的酸碱稳定性和热稳定性，其中Staphylococcus phage JD007能对来自临床的包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内的94％的金黄色葡萄球菌有杀菌作用，显示了良好的潜在应用价值。将Klebsiella phage JD001基因组上orf2和orf59编码类溶菌酶活性结构域的蛋白质并分别命名为LysKP2和LysKP1，对这两个基因进行克隆表达：发现LysKP2对肺炎克雷伯菌细胞壁有破坏作用，而且其具有类溶菌酶活性，最适酶活温度为30℃，在pH7-10能保持较高的酶活，EDTA、Cu2+、Mg2+和Triton X-100对酶活有促进作用，SDS则抑制其酶活。对LysKP1研究发现，其在细菌E.coliBL21内表达后对该细菌结构有破坏作用。这为深入研究Klebsiella phage JD001的杀菌机制奠定基础。本研究在建立了部分院内感染常见细菌的噬菌体库。鉴定了Klebsiella phageJD001、Staphylococcus phage JD007和Pseudomonas phage JD024这三株具有潜在临床应用价值的噬菌体。研究发现Klebsiella phage JD001内源性裂解酶LysKP2可从外部破坏作用肺炎克雷伯菌结构，且具有类溶菌酶酶活性，为了解Klebsiella phage JD001的杀菌的机制奠定基础。本研究为开发生态消毒剂，防治感染的特种辅料等产品奠定了基础。越来越多的研究显示菌群与一些疾病尤其是慢性疾病联系密切。本研究主要研究结核病病人呼吸道菌群组成。通过收集31例肺结核病人痰液和24个来自健康志愿者的上呼吸道分泌物样本，并且抽提其全部DNA。用带有标签的引物来扩增16S rRNA V3高变区，将扩增产物胶回收后建库，454焦磷酸测序后分析。结果：肺结核病人痰液菌群组成多样性要大于健康志愿者菌群组成（p<0.05）。所有所测序列被归为24个门，这24个门都发现于肺结核病人中，而其中只有17个门发现于健康志愿者中。进一步研究发现，一些外来菌比如：募养单胞菌属（Stenotrophomonas），贪铜菌属（Cupriavidus），假单胞菌属（Pseudomonas）,栖热菌属（Thermus），鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），甲基杆菌属（Methylobacterium），对氯苯胺降解菌属（Diaphorobacter），丛毛单胞菌属（Comamonas）和Mobilicoccus独特地存在于肺结核病人中。结论：本研究显示肺结核病人呼吸道菌群组成要比健康志愿者呼吸道菌群组成更加复杂，而且有很多外来菌存在于肺结核病人呼吸道中。这些外来菌在肺结核的发生和发展过程中产生的影响需要临床医生在治疗该病过程中考虑。