研究背景乳腺癌是威胁女性健康的主要疾病之一,且其发病率在世界范围内有上升趋势。传统的手术、放疗、化疗和内分泌治疗方法有其自身的局限性,因此寻找新的疗法迫在眉睫。随着肿瘤生物学及分子生物学等新兴学科的发展,肿瘤的基因治疗成为一种新的治疗模式,其中自杀基因疗法是较为有效和颇具临床应用潜力的治疗策略。自杀基因疗法是利用基因工程技术将一些病毒或细菌等原核生物含有,而哺乳动物细胞中不含有或表达水平极低的前药转换酶基因导入肿瘤细胞进行表达,其产物可使无毒性的前药变成细胞毒物质,从而达到杀伤肿瘤细胞的作用。基因治疗要求目的基因能在肿瘤细胞特异性表达而不在正常细胞中表达,一个能达到这一目的的方法是应用靶向技术向肿瘤区域精确目的基因。有研究利用肿瘤细胞特异性基因调控元件调控自杀基因表达,如以erbB-2启动子驱动乳腺癌的自杀基因治疗,AFP基因启动子用于原发性肝癌自杀基因疗法等。但上述策略只能针对某一特殊类型肿瘤,且仅靶向肿瘤细胞。随着人们对肿瘤新生血管在肿瘤生长及转移中的重要作用的认识,许多学者将治疗靶点转移到肿瘤血管上,通过抑制肿瘤新生血管生成,切断肿瘤供养来抑制肿瘤生长,减少肿瘤的浸润和转移。研究表明:肿瘤血管的生长速度是正常组织的50-100倍,肿瘤血管之所以能持续生长关键在于其血管内皮细胞的增殖能力,在肿瘤血管内皮细胞的增殖中,血管内皮生长因子（vascularendothelial cell growth factor,VEGF）是最重要的因子,VEGF促进肿瘤血管的生长必须与血管内皮细胞表面的VEGF第二受体（kinase-domain insert containingreceptor,KDR）相结合方能促使血管内皮细胞分裂、增殖。KDR高表达于增生活跃的肿瘤血管内皮细胞及多数肿瘤细胞,而在正常组织不表达或表达甚微,因此,以KDR启动子序列驱动自杀基因,可使自杀基因在肿瘤血管内皮细胞及肿瘤细胞特异性表达,从而达到双重靶向治疗作用。这样,放大治疗作用的同时,又适应于多种肿瘤治疗。利用KDR启动子驱动的双自杀基因特异性杀伤肿瘤和抑制其血液供应,国内外已有报道并取得良好疗效。现代分子生物学研究表明,肿瘤是一个多因素、多环节、多阶段、多基因参与的复杂疾病,而且在癌组织内可存在多种克隆的肿瘤细胞,不同类型的瘤细胞对不同基因治疗体系的敏感性有差异,所以单基因治疗常常不能取得良好的疗效。因此,联合基因治疗已成为目前肿瘤基因治疗的发展方向。联合基因治疗是指同时采用两种或两种以上的基因治疗策略来治疗肿瘤,利用各个基因治疗的优点,提高治疗效果,降低对机体正常组织的副作用。目前认为肿瘤不仅是细胞增殖分化异常性疾病,也是凋亡异常性疾病。凋亡调控失调可以异常地延长细胞的生存时间,促进有转化作用的基因突变的积累,并协助细胞抵抗免疫系统的监视作用,从而导致肿瘤的发生。随着对细胞凋亡调控异常在肿瘤发病学中的重要性的认识,在肿瘤细胞内导入凋亡活化基因或灭活凋亡抑制基因己构成肿瘤基因治疗中最诱人的策略之一。Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白,survivin在凋亡调节中起着重要作用。survivin在人胚胎组织中高度表达并参与胚胎发育过程中的组织分化和器官形成,而在终末分化的成人组织中检测不到,却又广泛表达于多种肿瘤组织。同时Survivin在非增殖性的毛细血管内皮中的表达量极低,而体内增殖性血管内皮中survivin的表达量很高。因此,Survivin可作为另一个肿瘤血管及肿瘤细胞双重治疗的理想靶点。目前,利用survivin反义寡核苷酸特异性诱导肿瘤细胞和其供血血管内皮细胞凋亡的研究已成为肿瘤治疗研究方面的热点。尽管自杀基因和survivin反义寡核苷酸肿瘤治疗上均取得一定的疗效,但肿瘤的复杂性和多样性决定了单一基因治疗常常不能取得良好的疗效。基于上述研究,为弥补单基因治疗的不足,发挥联合基因靶向治疗的优势,本课题拟联合应用腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK双自杀基因系统和survivin反义寡核苷酸,并观察两者单独及联合应用对乳腺癌MCF-7细胞及血管内皮ECV304细胞的体外靶向杀伤作用及其体内抑瘤效应,为进一步开展联合基因治疗乳腺癌的研究提供实验依据。注:本课题来源于:广东省科技计划项目基金（2005831201009）。目的研究KDR启动子驱动的双自杀基因在乳腺癌细胞MCF-7、血管内皮细胞ECV304内的转染及表达,给予前药后体外杀伤细胞的作用。观察survivin反义寡核苷酸对MCF-7和ECV304细胞中survivin基因表达的封闭作用和细胞的生长抑制作用。研究联合应用KDR启动子驱动的双自杀基因和survivin反义寡核苷酸作用MCF-7、ECV304细胞,观察两种基因在细胞内的表达及对细胞的增殖抑制作用。最后,以MCF-7细胞株建立裸鼠皮下移植瘤动物模型,观察联合基因治疗体系的体内抗肿瘤和抑制血管再生作用。方法一、重组腺病毒的包装、扩增、纯化及其滴度测定和鉴定携带KDR启动子调控下的CD与TK的融合基因腺病毒重组质粒pAdEsayKDRP-CDglyTK在293细胞中包装成病毒,并进一步扩增、纯化,通过荧光显微镜下293细胞中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达观察重组病毒的包装与复制,并以PCR方法鉴定重组腺病毒。二、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用用重组腺病毒AdKDR-CDglyTK感染MCF-7细胞、ECV304细胞及LS174T细胞（对照）,观察腺病毒的感染效率,RT-PCR方法检测目的基因的表达。在前药5-氟胞嘧啶（5-FC）和更昔洛韦（GCV）作用下,测定肿瘤细胞和血管内皮细胞的存活率,观察旁观者效应。三、survivin反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对MCF-7、ECV304细胞的生长抑制效应。针对survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸,采用脂质体介导转染MCF-7、ECV304细胞,采用western blot、RT-PCR方法检测survivin反义寡核苷酸对MCF-7、ECV304细胞survivin蛋白及mRNA表达的作用。测定转染前后细胞增殖活性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。四、KDR启动子驱动双自杀基因和survivin反义寡核苷酸联合应用对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用将重组腺病毒AdKDR-CDglyTK体外感染表达KDR的MCF-7、ECV304细胞株,同时用survivinASODN转染同一细胞株,观察腺病毒的感染效率和ASODN的转染情况,应用RT-PCR方法检测CDglyTK mRNA的表达,western blot方法检测基因转染对细胞survivin蛋白表达的影响。给予前药5-氟胞嘧啶（5-FC）和更昔洛韦（GCV）后,MTT法测定两者联合应用对细胞株的杀伤效应和旁观者效应,透射电镜观察细胞超微结构变化。五、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统联合survivin反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应采用BALB/C雌性裸鼠,4～6周龄,对数生长期的MCF-7细胞接种于裸鼠左侧腋窝皮下,建立乳腺癌动物模型,当肿瘤达0.5cm直径时,将荷瘤裸鼠随机分为4组,A组:阴性对照组(瘤体及瘤周注射Lipolifectmain^TM2000与前药5-FC、GCV);B组:survivinASODN治疗组（瘤体及瘤周注射survivin反义寡核苷酸）;C组:AdKDR-CDglyTK腺病毒治疗组（瘤体及瘤周注射重组腺病毒与前药5-FC和GCV）;D组:survivinASODN+AdKDR-CDglyTK腺病毒治疗组（瘤体及瘤周注射重组腺病毒与前药5-FC、GCV+survivin反义寡核苷酸）。治疗前后测量肿瘤体积,治疗结束后测肿瘤重量,计算肿瘤抑瘤率,观察该治疗体系的体内抑瘤效应。治疗结束后行组织内CDglyTK基因和survivin基因表达的检测、肿瘤组织透射电镜观察肿瘤细胞的超微结构变化及微血管密度（microvesseldensity,MVD）检查。结果一、重组腺病毒的包装、扩增、滴度测定及鉴定pAdEsay-KDR-CDglyTK经PacⅠ酶切线性化后,以Lipolifectmain^TM2000介导转染293细胞,24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达,3～5d表达达到高峰,7～10d多数细胞变圆并出现噬菌斑后收集细胞,反复冻融4次。收集上清液再次感染293细胞以大量扩增病毒。所得病毒纯化后滴度达2×10¹²pfu/ml。PCR鉴定:扩增出2.4kb的CDglyTK基因片断和580bp的KDR启动子片断。二、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用1.重组腺病毒对细胞的感染效率采用不同感染复数（multiple of infection,MOI）的重组腺病毒Ad-KDR-CDglyTK分别感染MCF-7、ECV304及LS174T细胞,72h后观察发现:细胞的感染率随腺病毒滴度的增加而递增,当MOI=10时,仅少数细胞有荧光;当MOI=100时,80%以上的GFP表达;MOI=200时,95%以上细胞被感染,重组腺病毒对三种细胞具有相似的感染效率。2.重组腺病毒感染细胞CDglyTK基因表达通过RT-PCR检测发现,除感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞外,余各组均检测到目的基因的表达。3.重组腺病毒对各细胞的体外抑制效应以MOI=100的重组腺病毒AdKDR-CDglyTK感染各细胞株,加入不同浓度的前药后MTT法检测细胞生长抑制率。结果:感染腺病毒AdKDR-CDglyTK的MCF-7及ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,转基因细胞的存活率随前药浓度的增加而递减,呈浓度-效应关系。而感染腺病毒AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感,转基因细胞的存活率不随前药浓度的改变而变化,细胞存活率差异无统计学意义（P=0.816）。;当GCV浓度高于40μg/ml,5-FC浓度高于250μg/ml时,在相同前药浓度下,MCF-7、ECV304细胞存活率低于LS174T细胞,差异有统计学意义（P＜0.001）。4.旁观者效应将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系对MCF-7和ECV304细胞存在旁观者效应,对LS174T细胞无旁观者效应。在转基因细胞所占比例相同的情况下,MCF-7和ECV304细胞存活率低于LS174T细胞存活率,差异有统计学意义（P＜0.001）。三、survivin反义寡核苷酸对MCF-7、ECV304细胞的生长抑制效应1.MTT法检测各组MCF-7、ECV304细胞生长抑制率空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组之间相比,细胞生长抑制率差异无统计学意义（P＞0.05）。Survivin反义寡核苷酸作用的三组分别与空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组相比,细胞生长抑制率显著升高（P＜0.001）。经不同浓度的survivinASODN处理的细胞均受到抑制,随着survivinASODN浓度的增加,抑制作用越来越明显,呈浓度-效应关系,不同浓度ASODN组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。2.MCF-7、ECV304细胞survivin mRNA的表达对照组和survivinASODN处理组均在191bp处出现特异性的survivin条带。空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组之间比较,survivin mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml survivinASODN转染后,survivin mRNA表达与三组对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。随着ASODN浓度的增加,survivin mRNA的表达呈逐渐降低的趋势,不同浓度ASODN组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。3.MCF-7、ECV304细胞survivin蛋白的表达Survivin蛋白在MCF-7、ECV304细胞中有高度表达。空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml survivinASODN转染后survivin蛋白与三组对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。随着ASODN浓度的增加,survivin蛋白的表达呈逐渐降低的趋势,不同浓度ASODN组之问相比差异有统计学意义（P＜0.05）。4.Survivin ASOON对MCF-7、ECV304细胞凋亡率的影响经200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml survivinASODN处理MCF-7、ECV304细胞48h后,与空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组相比,survivinASODN组在G₁期前出现明显的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率与三组对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。随着ASODN浓度的增加,细胞凋亡率呈逐渐上升的趋势,不同浓度ASODN组之间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。四、KDR启动子驱动双自杀基因和survivin反义寡核苷酸联合应用对MCF-7细胞及ECV304细胞的体外杀伤作用1.SurvivinASODN对MCF-7、ECV304细胞的转染和重组腺病毒的感染效率转染400ng/ml survivin ASODN后,56%MCF-7细胞和51%ECV304细胞的胞核、胞浆见到棕色荧光。MOI=100的重组腺病毒感染细胞后,84%MCF-7细胞和78%ECV304细胞GFP表达阳性。SurvivinASODN和重组腺病毒联合作用后,52%MCF-7细胞和49%ECV304细胞内见到棕色荧光,与survivinASODN组比较无显著性差异（P＞0.05）;同时86%MCF-7细胞和72%ECV304细胞内有绿色荧光出现,与AdKDR-CDglyTK组比较无显著性差异（P＞0.05）。2.转基因MCF-7、ECV304细胞survivin蛋白表达Survivin蛋白在MCF-7、ECV304细胞中有高度表达。阴性对照组、AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）;但与survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。3.转基因细胞CDglyTK基因表达通过RT-PCR检测MCF-7和ECV304细胞,发现阴性对照组、survivinASODN组细胞中无CDglyTKmRNA表达,其余两组细胞中均有CDglyTKmRNA表达。4.基因转染对MCF-7、ECV304细胞的体外抑制效应阴性对照组细胞均对前药不敏感,当GCV、5-FC浓度分别高于40μg/ml、250μg/ml时,在相同GCV、5-FC浓度条件下,阴性对照组MCF-7、ECV304细胞存活率与其他组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。survivinASODN与AdKDR-CDglyTK基因联用后,随着前药浓度的增加,细胞存活率迅速下降,有显著性差异（P＜0.001）。当GCV、5-FC浓度分别高于40μg/ml、250μg/ml时,在相同GCV、5-FC浓度条件下,survivinASODN与AdKDR-CDglyTK基因联合作用组细胞存活率低于survivinASODN组或AdKDR-CDglyTK组,差异有统计学意义（P＜0.001）。但在GCV100μg/ml、5-FC2000μg/ml时,联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR-CDglyTK,两者间无显著差异（P＞0.05）。SurvivinASODN与AdKDR-CDglyTK两者联合使用的相互作用指数CDI值＜1,在GCV60μg/ml、5-FC500μg/ml时,CDI值＜0.7,但在GCV100μg/ml、5-FC2000μg/ml时,CDI值＞1。5.旁观者效应阴性对照组无旁观者效应,在相同比例混合细胞和相同前药浓度下,survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组细胞存活率均低于AdKDR-CDglyTK组和survivinASODN组（P＜0.05）,提示联合基因治疗组较单一基因治疗具有更强的旁观者效应。6.联合基因治疗后MCF-7及ECV304细胞的电镜观察电镜下观察:可见部分细胞体收缩、染色质边聚,有些胞核形态不规则,核发生碎裂,胞浆内可见多个电子密度增强的核碎片（凋亡小体）,有些整个凋亡细胞被吞噬和降解。五、腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统联合survivin反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞裸鼠模型的体内抑瘤效应1.基因治疗对裸鼠移植瘤的抑制作用开始治疗前,阴性对照组、survivinASODN组、AdKDR-CDglyTK组、SurvivinASODN+AdKDR-CDglyTK组肿瘤平均体积无显著性差异（P＞0.05）。治疗结束时,阴性对照组肿瘤体积较治疗前显著增大（P＜0.001）,其他3组治疗组肿瘤体积均低于治疗前,有显著性差异（P＜0.05）。3组治疗组肿瘤体积均低于阴性照组肿瘤体积,有显著性差异（P＜0.001）。联合基因治疗组肿瘤体积与单一基因组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗结束后处死裸鼠,剥离肿瘤测重量,survivinASODN组、AdKDR-CDglyTK组、SurvivinASODN+AdKDR-CDglyTK组肿瘤重量较阴性对照组有不同程度的降低,差异具有统计学意义（P＜0.001）。联合基因治疗组肿瘤重量与单一基因组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）。抑瘤率测定可见联合基因治疗组明显高于survivinASODN组和AdKDR-CDglyTK组,差异在统计学上均有显著性意义（P＜0.05）。2.裸鼠移植瘤MVDCD34抗体染色大部分毛细微血管和单个内皮细胞。SurvivinASODN、AdKDR-CDglyTK组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组移植瘤MVD显著低于阴性对照组MVD（P＜0.05）,survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组肿瘤MVD最少,与survivinASODN组、AdKDR-CDglyTK组比较均有显著性差异（P＜0.05）。3.裸鼠移植瘤细胞survivin蛋白表达Survivin蛋白在裸鼠移植瘤细胞中有高度表达。阴性对照组、AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）;但与survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。survivinASODN组、survivinASODN+AdKDR-CDglyTK组之间比较survivin蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。4.裸鼠移植瘤细胞CDglyTK mRNA表达通过RT-PCR检测裸鼠移植瘤细胞,发现阴性对照组、survivinASODN组细胞中无CDglyTKmRNA表达,其余两组细胞中均有CDglyTKmRNA表达。5.裸鼠移植瘤细胞的电镜观察联合基因治疗组细胞皱缩,细胞膜微绒毛消失。细胞核膜亦发生皱缩或消失,染色质浓缩,沿核膜下排列成不同形状和大小的块状,或发生断裂,致密的凋亡小体亦较多见。结论1.本实验构建了KDR驱动CD/TK自杀基因系统的重组腺病毒,重组腺病毒对MCF-7细胞、ECV304细胞及LS174T细胞均具有较高的转染率,且对三者转染率相似;2.重组腺病毒能将KDR驱动的CD/TK融合基因转入MCF-7细胞及ECV304细胞中并进行有效表达,对MCF-7细胞及ECV304细胞具有靶向杀伤作用,这种杀伤作用具有浓度依赖性;3.该治疗体系的作用机制为对靶细胞的直接杀伤作用及旁观者效应;4.脂质体介导转染针对survivin mRNA的反义寡核苷酸可在mRNA及蛋白两个水平上有效地降低MCF-7,ECV304细胞内survivin的表达;5.经不同浓度的survivinASODN处理的MCF-7,ECV304细胞的增殖均受到抑制,随着survivin ASODN浓度的增加,抑制作用越来越明显,呈浓度-效应关系;survivinASODN的作用机制为诱导靶细胞的凋亡;6.KDR启动子驱动的双自杀基因重组腺病毒与survivinASODN可同时作用于MCF-7、ECV304细胞,而相互并不影响各自携带的基因在细胞内的转染;7.KDR启动子驱动的双自杀基因重组腺病毒和survivinASODN相互不影响各自携带的基因在MCF-7、ECV304细胞内的表达;8.在前药浓度较低时,AdKDR-CDglyTK和survivinASODN联合基因作用较单一基因对MCF-7,ECV304细胞具有更强的杀伤作用,并且两基因存在协同作用;9.AdKDR-CDglyTK和survivinASODN联合治疗组较单一基因表现出更强的旁观者效应;10.腺病毒介导的KDR-CDglyTK融合基因系统和survivinASODN对乳腺癌裸鼠移植瘤及其MVD均具有明显的抑制作用,联合基因较单一基因具有更强的抗肿瘤和抑制MVD作用;11.Survivin蛋白在裸鼠移植瘤细胞中有高度表达,SurvivinASODN可下调survivin蛋白表达。重组腺病毒能将KDR驱动的CD/TK融合基因导入乳腺癌裸鼠移植瘤细胞中并进行有效表达;12.携带双自杀基因的重组腺病毒与survivinASODN可同时作用于乳腺癌裸鼠移植瘤细胞,而相互并不影响各自携带的基因在肿瘤细胞内的表达。