心脏是人体在胚胎发育阶段最早形成的器官,也是人体最重要最保守的器官之一。心脏由心肌细胞和其他细胞(成纤维细胞,淋巴管,血管等)组成,心肌细胞数量占总数量的25%左右,体积却占心脏体积的75%左右。心衰是导致人类死亡的重要原因之一,而心衰往往由心肌肥厚发展而来,因此研究心肌肥厚的发病机制具有重大的现实意义。心肌肥厚是心脏在早期阶段为应对各种压力、维持心脏功能所表现出的适应性反应。然而持续的心肌肥厚和伴随着的心肌重塑往往导致心衰、心源性死亡的风险增加。虽然各种特殊的肽激素、生长因子和小RNA已经被证实参与心肌肥厚的调节,但心肌肥厚的机制依然没有被完全了解。长非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸,不能编码蛋白质的RNA,其在生命过程中发挥重要而复杂的作用,参与诸如RNA加工,细胞命运决定,染色质修饰等过程。有研究证实lncRNA还可以作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)发挥作用。最近几年有研究发现lncRNA参与调节心脏的发育与疾病过程。Braveheart lncRNA可以在小鼠胚胎干细胞分化期间刺激干细胞转变为心脏细胞。MIAT在第5外显子上的SNP变异增加了MIAT的转录,可能与心肌梗塞发生相关。LncRNA ANRIL定位于9p21,它的失调会引起心肌细胞增殖异常和冠脉疾病。对TAC手术导致心肌肥厚的小鼠心脏组织进行转录组测序研究发现众多lncRNA在心肌肥厚早期和心衰期表达水平发生明显改变,提示lncRNA在心肌肥厚和心衰中发挥了重要功能。因此lncRNA已逐渐成为心血管基础和临床研究的一个新的热点和重点。作为最早被发现的印记基因,lncRNA H19被证实在哺乳动物胚胎发育和肿瘤发生过程中具有重要作用。H19的第一外显子能够编码miR-675,已有研究证实H19在很多病理生理过程中发挥的功能都是通过miR-675介导的。近几年来的多项研究表明,在对病理性心肌肥厚小鼠模型进行差异表达的lncRNA筛选时,H19表达水平有明显的上调,提示其可能在心肌肥厚中发挥作用,但迄今为止关于H19在心脏组织中的具体功能及相关机制依然鲜见报导。本研究旨在探索H19在心肌肥厚过程中发挥的功能,并探索其相关的作用机制。我们首先在不同类型的心肌肥厚小鼠模型及人心衰标本中检测了H19及其编码的miR-675的表达,发现两者在病理性心肌肥厚模型和心衰样品中表达水平明显上调,而在运动诱导的生理性心肌肥厚小鼠模型中检测时发现两者的表达下调。为了研究H19在心肌细胞中的功能,我们构建和包装了用于过表达H19的腺病毒,并用其在体外感染分离的原代心肌细胞。通过对心肌细胞形态学分析和肥大标志基因表达水平的检测,发现过表达H19能够在体外抑制心肌细胞的肥大生长。另一方面,我们也在体外通过转染si-h19的方式来敲低原代心肌细胞中内源性h19的表达,发现h19的敲低会促进心肌细胞的肥大生长。为理解h19抑制心肌细胞肥大生长的机制,我们采取了以下策略探索h19在心肌细胞中的功能是否是由mir-675介导的。首先,我们在体外原代心肌细胞中过表达或敲低mir-675,发现mir-675也能够在体外抑制心肌细胞的肥大生长。进一步,我们在原代心肌细胞中过表达h19的同时敲低mir-675,心肌细胞形态学分析和肥大标志基因表达水平的检测显示,敲低mir-675能够有效地挽救由于h19过表达所引起的心肌细胞尺寸的减小。此外,我们还分别包装了包含缺失编码mir-675前体序列的h19截短体(h19-tru)和突变型mir-675前体序列的h19突变体(h19-mut)的腺病毒,并分别进行心肌细胞的感染。结果发现,两种形式的腺病毒都能有效地使h19在心肌细胞内过表达,但是对心肌细胞内mir-675的表达无明显影响。形态学分析以及肥大标志基因表达水平的检测显示h19-tru和h19-mut都失去了抑制心肌细胞肥大生长的能力。所有这些结果都表明mir-675能够介导h19抑制心肌细胞肥大生长的功能。我们对h19/mir-675的作用机制进行了进一步探索。利用targetscan预测了mir-675可能作用的靶分子,从中选择了具有促进心肌肥厚功能的钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶iiδ(camkiiδ)进行了系统分析。首先,我们构建了包含正常的及突变型的camkiiδ3’-utr的荧光素酶报告载体,并与mir-675共同转染293t细胞。结果显示mir-675能有效地抑制camkiiδ的3’-utr活性,而mir-675对突变型载体则丧失了这种抑制作用。进一步对camkiiδ表达水平的检测显示mir-675能明显抑制camkiiδ在mrna和蛋白水平的表达。这些结果表明camkiiδ是mir-675直接作用的靶标分子。为了验证心肌细胞内h19发挥的功能是否是由camkiiδ介导的,我们在体外原代心肌细胞中敲低h19的同时敲低camkiiδ,发现camkiiδ的敲低能部分缓解h19敲低所引起的心肌细胞尺寸的增加,表明camkiiδ能部分介导h19抑制心肌细胞肥大生长的功能。为了研究h19/mir-675在体内心脏稳态维持中的功能,我们考察了在体内抑制mir-675的表达对tac手术引起的心肌肥厚的影响。我们对2月龄的c57雄鼠进行了tac手术,在术后1周经确认发生心肌肥厚后,通过鼠尾静脉注射mir-675抑制剂(antagomir-675),并在注射3周后进行心脏取材和分析。我们发现在体内应用antagomir-675能有效地缓解tac手术引起的mir-675表达水平的升高,并且加重了压力性负荷引发的心肌肥厚,提示在体内抑制mir-675会促进心肌肥厚的发生。综上所述,我们的研究首次揭示了h19/mir-675可通过靶向camkiiδ抑制心肌肥厚的新功能,为了解心肌肥厚的发生机制提供了新的理论基础,为心脏疾病的治疗提供了新的靶标。