【摘 要】
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MicroRNAs是一种具有调控功能的短链微小非编码RNA,其大小长约18～24个核苷酸,能够参与动物基因的转录后表达调控,在动物的生长、发育等生命活动中均起到极其重要的作用。肌内脂肪含量直接影响牛肉的嫩度、风味等指标,而水牛肉肌内脂肪含量较黄牛肉低,其口感远不如黄牛,严重影响我国水牛的肉用生产。为挖掘水牛脂肪沉积相关miRNA,获得可用于水牛肉品质改良的潜在miRNA。本实验以信阳水牛为材料,构
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MicroRNAs是一种具有调控功能的短链微小非编码RNA,其大小长约18～24个核苷酸,能够参与动物基因的转录后表达调控,在动物的生长、发育等生命活动中均起到极其重要的作用。肌内脂肪含量直接影响牛肉的嫩度、风味等指标,而水牛肉肌内脂肪含量较黄牛肉低,其口感远不如黄牛,严重影响我国水牛的肉用生产。为挖掘水牛脂肪沉积相关miRNA,获得可用于水牛肉品质改良的潜在miRNA。本实验以信阳水牛为材料,构建水牛不同发育阶段背部皮下脂肪组织的小RNA测序文库,结合高通量测序技术与生物信息学分析方法,筛选出不同发育阶段表达差异的miRNA。预测候选miRNAs靶基因,筛选与脂肪沉积相关的miRNAs-靶基因互作对。利用qRT-PCR技术验证测序结果并进行组织表达谱分析。进一步通过agomiR过表达可能调控水牛脂肪沉积的miRNAs,检测其对牛脂肪细胞分化的影响;通过双荧光素酶报告系统验证miRNA-靶基因作用关系,以便在信阳水牛的分子育种与肉用选育方面提供新的理论依据。本次研究主要工作及结果如下:1.进行高通量测序,构建信阳水牛幼年牛（6月龄）和成年牛（30月龄）背部皮下脂肪组织小RNA测序文库,分析鉴定获得807个miRNA,其中新发现的miR NAs有355个。差异表达分析表明两个文库差异表达的miRNA一共有282个,随着年龄增长有148个miRNA上调,134个miRNA下调。对差异表达的miRNA进行靶基因预测并筛选可能与脂肪沉积相关的靶基因,最终筛选出bta-miR-195-THRSP、bta-miR-195-EGR1、bta-miR-24-3p-DGAT2与novel＿miR-7＿28313-SREBF1这4对可能与脂肪分化相关的miRNA-靶基因互作对。2.定量检测差异表达的候选miRNAs转录本鉴定结果与测序结果一致。组织表达谱分析结果表明,bta-miR-195在心、肺、脂肪组织中有较高表达;bta-miR-192在肝脏组织中高表达;bta-miR-24-3p在心脏组织中高表达,在肌肉和脂肪组织中有较高表达;novel＿miR-7＿28313在肾脏中高表达,在肝和脂肪组织中有较高表达。在离体培养的牛原代脂肪细胞诱导分化过程中bta-miR-195、bta-miR-192、novel＿miR-7＿28313表达水平随脂肪细胞分化成熟过程出现明显的动态表达,说明其在脂肪调节过程中发挥重要作用。3.在牛原代脂肪细胞中过表达bta-miR-195与bta-miR-192抑制脂肪细胞的脂质积累,抑制成脂标志基因PPARγ与CEBPα表达,抑制靶基因THRSP与EGR1表达。双荧光素酶报告试验显示bta-miR-195能与THRSP 3’UTR结合并下调荧光素酶活性,证明bta-miR-195能够靶向THRSP。
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