猪的体细胞克隆在农业和医学领域具有巨大的应用前景,尤其体现在作为研究人类疾病的动物模型、人类异种器官移植方面。本研究利用屠宰场猪卵巢,对体细胞克隆胚胎生产中的一系列相关因素进行研究,为转基因克隆猪的生产奠定了基础,结果如下。不同时间段添加外源激素对猪卵母细胞体外成熟的影响:猪卵母细胞以NCSU23+10%pFF+10IU/mLPMSG+10IU/mLhCG+10ng/mLEGF为成熟液体外培养44h:前22h在培养液中添加激素,后22h不加激素以及添加激素连续培养44h。结果发现:后22h去除激素显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率(P<0.05),对卵母细胞的核成熟影响不大,因此,在体外成熟的后22h将激素去除是有必要的。猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的方案:⑴不同的电场强度的影响:电场强度为2.0kv/cm时,卵裂率、囊胚率均显著高于其他两组(1.6kv/cm,2.4kv/cm)(P<0.05);⑵放线菌酮(cycloheximide,CHX)不同添加方式对激活效果的影响:发现电激活前用10μg CHX处理MⅡ期卵母细胞,卵裂率有显著的提高(P<0.05),囊胚发育率也有提高;电激活前用10μg CHX处理MⅡ期卵母细胞0、10、60min,与对照组相比,处理卵母细胞60min,囊胚率显著提高(P<0.05);MⅡ期卵母细胞进行电激活后,辅助10μgCHX作用,卵裂率、囊胚率都有显著的提高(P<0.05);MⅡ期卵母细胞进行电激活后,辅助10μg CHX作用(3h、4h、5h),提高了孤雌胚胎发育率,各组之间差别不大;MⅡ期卵母细胞进行电激活1h后再用CHX辅助激活,与激活后直接加入CHX相比,卵裂率、囊胚率有显著的提高(P<0.05)。不同培养密度对孤雌胚胎发育的影响:25、45、65枚/50μl的培养密度下,卵裂率、囊胚率没有显著的差异(P>0.05),但45枚/50μl的培养密度下胚胎的发育率稍高。TSA对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响:5nM TSA处理对卵母细胞体外核成熟无显著影响,并且显著提高了其后孤雌胚胎卵裂率、囊胚率(P<0.05);50nM TSA处理显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率(P<0.05);50nM TSA处理24h能显著提高胚胎的卵裂率、囊胚率(P<0.05 )。⑴重构胚构建后,有必要恢复一段时间再进行融合,研究了不同的恢复时间对于(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)胚胎发育的影响,结果显示,恢复时间(1～2h)时,重构胚融合率显著提高,但是,导致碎裂率的显著上升(P<0.05 ),影响了囊胚的发育;恢复20～40min有利于胚胎的正常发育;⑵不同的融合激活间隔时间对SCNTs发育的影响,融合后不再进行二次激活的组作为对照,与融合后0.5～1h、1.5～2h再次进行激活的效果相比,融合激活间隔时间为1.5～2h时显著提高了胚胎发育率(P<0.05)。对比供体细胞转基因与否对克隆胚胎发育的影响,结果发现两种细胞作为核供体时,早期克隆胚胎的发育无显著差异(P>0.05)。总之,通过对体细胞克隆过程中的一系列环节进行优化,建立了一个相对稳定的技术平台;并尝试研究了CHX对于卵母细胞孤雌激活的影响;TSA对卵母细胞体外成熟以及孤雌胚胎发育的影响,取得了初步的结果。