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病毒(virus)是一类个体微小、结构简单的非细胞结构型微生物,其引起的艾滋、肝炎、埃博拉等病毒性疾病严重危害人类健康.疫苗是预防病毒感染的重要手段,然而,许多病毒存在抗原性不一的多种血清型或亚型,如脊髓灰质炎病毒有 3种血清型、甲型流感病毒存在多种亚型(H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等)、登革病毒拥有 4种血清型等,理想的疫苗应对多种血清型均有效,但在这些拥有多种血清型或亚型的病毒疫苗制备中具有极大的挑战性.通常,需要利用不同的生产工艺路线将每一种血清型的病毒疫苗株单独制备,再分别接种或混合接种,以实现预防效果.因此,研制一种能承载多种病毒抗原、制备多价病毒疫苗的递送系统具有重要的理论和现实意义. 细菌膜泡(membrane vesicles, MVs)是细菌在生长过程中通过出芽方式自然释放的球形双层膜结构.革兰阴性菌细胞壁具有双层膜结构,其膜泡的产生于20世纪60 年代即被发现.革兰阴性菌膜泡由细菌外膜产生,故被称为外膜膜泡( outer membrane vesicles, OMVs);而革兰阳性菌细胞壁由较厚肽聚糖层组成,只有一层细胞膜,缺乏外膜结构,其产生膜泡的能力直到 2009年才由韩国科学家Lee等发现.研究表明,不论是革兰阴性菌的OMVs,还是革兰阳性菌的MVs,都是纳米级脂质膜结构,大小在20~250 nm之间;既可携带宿主菌来源的蛋白质(如膜蛋白、脂蛋白、细菌毒素)和脂质(如革兰阴性菌的LPS),也可携带宿主菌来源的核酸(如质粒、染色体片段、RNA),因而具有多种生物学活性,在细菌的定植和致病过程中发挥重要作用.同时,研究发现无毒或经过人工减毒的细菌膜泡又可被当作疫苗或疫苗递送系统进行开发利用.多种致病菌(如类鼻疽伯克霍尔德菌、霍乱弧菌、脑膜炎奈瑟菌等)产生的OMVs可保护动物免受相应致病菌的感染,即可发挥疫苗作用.如脑膜炎奈瑟菌的膜泡疫苗已在进行Ⅲ期临床实验.研究还发现,细菌膜泡具有佐剂活性.如脑膜炎奈瑟菌膜泡可显著增强重组抗原的免疫原性;利用重组质粒在大肠埃希菌中表达衣原体的丝氨酸蛋白酶HtrA,由此制备的膜泡可成功诱导小鼠产生抗衣原体的中和抗体,而单纯重组的HtrA蛋白则不能. 与革兰阴性菌相比,革兰阳性菌细胞壁没有内毒素,故用革兰阳性菌膜泡作为疫苗的递送载体从理论上讲更安全.本研究以革兰阳性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称金葡菌)为对象,构建了金葡菌膜泡递送系统,发现将控制金葡菌毒力基因表达的Agr系统敲除后所产生的膜泡之毒力大大降低,进一步从膜泡主成分中鉴定出至少 4种高丰度的蛋白质具有携带外源抗原分子的能力,并以4种血清型登革病毒的特异性抗原为模型,通过基因工程技术将 3种登革病毒的保护性抗原分别重组到膜泡主成分的编码基因上,利用金葡菌的膜泡分泌机制,研发并制备了多价登革热膜泡疫苗,并进行了初步的免疫效能评价. 主要研究内容和结果如下: 一、减毒金葡菌膜泡递送系统的构建 1. 金葡菌膜泡产生特性分析及菌株筛选:分别对金葡菌RN4220、N315、Newman、Mu50、ATCC25923 等菌株进行培养,经高速离心、超滤浓缩、超速离心等步骤制备金葡菌膜泡.蛋白定量分析显示上述金葡菌均能产生膜泡,产量分别为 957.15 ± 97.2 μg/L,1082.6±180.3 μg/L,555.8±74.7 μg/L,855.4±171.2 μg/L,1112.6±474.3μg/L,各菌株的膜泡产量无统计学差异.电镜观察发现这些菌株分泌的膜泡为圆形或椭圆形结构,直径为43.5±12 nm;SDS-PAGE电泳发现各金葡菌菌株分泌的膜泡所携带的蛋白成分具有菌株特异性.根据毒力基因延迟表达和良好的遗传操作性能,我们选取了金葡菌RN4220作为构建膜泡递送系统的出发菌株. 2. 减毒金葡菌膜泡递送系统的建立及毒性评价:培养金葡菌 RN4220,收集不同培养时间产生的膜泡,定量分析发现培养 22 h的细菌膜泡产量最高.遗憾的是,培养22 h收集的金葡菌膜泡按50μg/只剂量腹腔注射BALB/c小鼠,结果80%小鼠死亡,表明 RN4220 野生株产生的膜泡具有毒性.因膜泡携带上百种抗原成分,要鉴别出每一种毒性成分并加以消除,从技术上难以实现.金葡菌的毒力因子主要受Agr 系统调控,于是我们利用同源重组方法对金葡菌 RN4220 的全局性毒力调控系统Agr进行敲除,构建RN4220-Δagr工程菌.从敲除菌培养上清中提取膜泡并攻击小鼠,发现其毒力较野生株膜泡大大降低.Agr 敲除菌膜泡攻击小鼠血清中的炎症因子IL-6和TNFɑ明显降低,小鼠肝损害指标ALT、AST、LDH等也明显较野生株低.毒力检测表明,金葡菌 RN4220 野生菌所产生膜泡的小鼠半数致死量(LD50)为2.1±0.25 mg/kg,而Agr系统敲除菌之膜泡按10 mg/kg进行小鼠攻击仍全部存活.以上结果表明,RN4220-Δagr 工程菌产生的膜泡毒力明显降低,减毒金葡菌膜泡可作为安全的膜泡疫苗递送平台. 二、减毒金葡菌膜泡递送系统的抗原递送能力研究 1. 减毒金葡菌膜泡递送系统的成分分析及候选抗原融合靶标的筛选:通过蛋白质组学方法对减毒金葡菌膜泡进行成分分析,质谱结果显示减毒金葡菌膜泡中含有119种蛋白质成分,在此基础上,结合膜泡蛋白的 SDS-PAGE电泳,选取了 8条丰度较高的膜泡蛋白条带作为外源抗原的候选融合分子,再经质谱鉴定并确认其中的7种主成分为PdhB、Eno、Mntc、PdhA、Rple、PdhC和GlnA蛋白. 2. 候选疫苗融合靶标的递送能力研究:为验证所筛选的候选融合分子的抗原递送能力,我们选用3×FLAG标签蛋白作为模式外源抗原分子,利用同源重组的方法与上述已鉴定的7种候选融合靶标进行重组表达.Western blot鉴定结果表明只有PdhB、Eno、Mntc、PdhA能够成功融合并表达外源抗原,而Rple、PdhC、GlnA融合表达 3×FLAG 标签不成功,因此我们选用这 PdhB、Eno、Mntc、PdhA 等四种膜泡主成分蛋白作为减毒膜泡递送系统的外源抗原融合靶标. 3. 外源抗原融合靶标的含量测定:我们利用经亲和层析纯化的Eno-FLAG蛋白作为标准,采用定量Western blot方法对减毒金葡菌膜泡递送系统中的Eno、PdhB、Mntc和PdhA蛋白含量进行测定,结果显示其含量分别为2.64±0.61 %,5.07± 0.82%,3.43±0.73 %和2.64±0.61 %. 三、多价重组登革热膜泡疫苗的构建及免疫效能研究 1. NS1重组蛋白及抗体制备:重组表达和纯化登革病毒NS1蛋白,并免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定结果显示,制备的 NS1多克隆抗体效价为1:102400. 2. 重组登革热膜泡疫苗工程菌构建:应用同源重组方法,将登革病毒保护性简并抗原EDIIIconA(代表DENV-1和DENV-3)、EDIIIconB(代表DENV-2和DENV-4)及 NS1 依次与外源抗原融合靶标 Eno、PdhB、Mntc 进行融合表达,构建多价登革热膜泡疫苗工程菌并进行Western blot鉴定,结果显示减毒金葡菌膜泡系统能成功表达并递送上述登革热保护性抗原. 3. 重组登革热膜泡疫苗的免疫效能研究:制备多价登革热膜泡疫苗并免疫小鼠制备抗血清,通过间接免疫荧光、乳鼠被动保护及ELISA实验分析膜泡免疫小鼠抗体的保护作用及对 4 种重组登革病毒 EDIII 的效价,结果显示,重组登革热膜泡疫苗能够诱导小鼠保护性免疫反应,所产生的抗体能够保护机体抵抗登革病毒的感染且对各血清型登革病毒EDIII均有良好的结合能力. 综上所述,本文在构建安全可靠的金葡菌膜泡递送系统基础上,利用金葡菌膜泡递送载体制备的多价重组登革热膜泡疫苗具有良好的免疫保护作用,为今后其他多价病毒疫苗研制提供了全新的技术平台.