论文部分内容阅读
第一部分氧化低密度脂蛋白和洛沙坦对树突状细胞免疫成熟的影响目的：探讨血管紧张素Ⅱ受体1(AT1)拮抗剂(ARB)类药物洛沙坦对由氧化低密度脂蛋白(OxLDL)诱导的人单核细胞源树突状细胞(DCs)免疫成熟进程的影响。方法：采用密度梯度离心结合免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,经含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养液培养5天,使其分化为未成熟DCs。在细胞培养的第六天分别加入终浓度为10、50、100μg/ml的OxLDL,干预24小时,另用10μM的洛沙坦预干预24小时后再加入50μg/ml OxLDL干预24小时,以PBS作为阴性对照。采用流式细胞术检测细胞免疫表型(CD80、HLA-DR), ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子(IL-10、IL-12和IFN-γ)的浓度。结果：与PBS组相比,OxLDL干预呈浓度依赖性上调DCs表面共刺激分子CD80和成熟度标志HLA-DR的表达,且分泌细胞因子IL-10、IL-12和IFN-γ水平明显升高,也呈浓度依赖性。与浓度为50μg/ml的OxLDL干预组相比,10μM洛沙坦预处理可明显抑制OxLDL诱导的CD80、HLA-DR表面分子的表达,并减弱OxLDL诱导的DCs分泌细胞因子IL-10、IL-12和IFN-γ。结论：OxLDL是DCs免疫成熟和功能活化的重要刺激因素,而ARB类药物洛沙坦可抑制OxLDL诱导的DCs免疫成熟,这可能是其抗AS的一个重要机制。第二部分血管紧张素Ⅱ和洛沙坦对树突状细胞免疫成熟的影响目的：探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)和洛沙坦对人单核细胞源DCs免疫成熟进程的影响。方法：采用密度梯度离心结合免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,经含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养液培养5天,使其分化为未成熟DCs。在细胞培养的第六天分别加入终浓度为10nM、100nM的AngⅡ干预24小时,另用10μM的洛沙坦预干预24小时后再加入100nM的AngⅡ干预24小时,以PBS作为阴性对照。采用流式细胞术检测细胞免疫表型(CD80、HLA-DR), ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子(IL-10、IL-12和IFN-γ)的浓度。结果：与PBS组相比,AngⅡ干预后DCs表达共刺激分子CD80和成熟度标志HLA-DR明显增加,且分泌细胞因子IL-10、IL-12和IFN-γ水平明显升高,均呈浓度依赖性。与浓度为100nM AngⅡ干预的DCs相比,10μM的洛沙坦预处理可明显抑制AngⅡ诱导的CD80、HLA-DR表面分子的表达和细胞因子IL-10、 IL-12和IFN-γ的分泌。结论：AngⅡ是DCs免疫成熟和功能活化的重要刺激因素,而ARB类药物洛沙坦通过阻断AT1可抑制AngⅡ诱导的DCs免疫成熟,这可能是其抗AS的一个重要机制。第三部分洛沙坦对树突状细胞免疫成熟影响的机制研究目的：探讨ARB类药物洛沙坦对OxLDL和AngⅡ诱导的人单核细胞源DCs免疫成熟影响的机制。方法：采用密度梯度离心结合免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,经含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培养液培养5天,使其分化为未成熟DCs。根据干预因素的不同将细胞分为下列七组①10μg/ml OxLDL、②50μg/ml OxLDL、③100μg/ml OxLDL、④50μg/ml OxLDL+10μM洛沙坦、⑤10nM AngⅡ、⑥100nM AngⅡ、⑦100nM AngⅡ+10μM洛沙坦,干预24小时后收集细胞,以PBS作为阴性对照。采用ELISA法检测上述①-④组细胞培养上清液中AngⅡ的浓度,采用Real-time PCR法和Western-blot法分别检测DCs清道夫受体SR-A、CD36和LOX-1的mRNA和蛋白的表达。结果：与PBS组相比,不同浓度OxLDL干预可浓度依赖性促进DCs自分泌AngⅡ；与浓度为50μg/ml OxLDL干预的DCs相比,10μM的洛沙坦预处理对AngⅡ的分泌无明显影响。未经干预的DCs可表达少量的清道夫受体,OxLDL干预后呈浓度依赖性上调SR-A、CD36和LOX-1mRNA和蛋白的表达；与浓度为50μg/ml的OxLDL干预相比,10μM洛沙坦预处理可明显抑制LOX-1mRNA和蛋白的表达,但SR-A和CD36的表达无明显变化。与PBS组相比,AngⅡ干预也可浓度依赖性上调LOX-1mRNA和蛋白的表达,但对SR-A和CD36的表达无明显影响；与浓度为100nM的AngⅡ干预相比,10μM洛沙坦预处理可明显抑制(?)LOX-1mRNA和蛋白的表达,但SR-A和CD36的表达无明显变化。结论：AngⅡ可通过活化AT1受体,上调LOX-1的表达,促进DCs对OxLDL的摄取,这可能是AngⅡ促AS的新机制；OxLDL可呈浓度依赖性上调DCs表面多种SR的表达,还可通过促进DCs自分泌AngⅡ而与之形成活化DCs的协同作用；洛沙坦可同时抑制AngⅡ和OxLDL诱导的LOX-1的表达,可能是洛沙坦抑制DCs免疫成熟的机制之一。