灵芝是一种珍贵的高等药用真菌和名贵中草药,用它来预防和治疗疾病已有几千年历史。灵芝酸作为灵芝的重要药用成分之一,具有抗癌、抗爱滋病、免疫调节等活性,至今已报道了一百多种(称之为单体灵芝酸,以区别于总灵芝酸)。研究还表明结构类似的单体灵芝酸具有不同的生物活性。由于其重要的药理作用,近年来灵芝酸成为国内外研究的一个热点。尽管关于加速灵芝细胞生长和优化总灵芝酸生产有一些报道,目前灵芝酸的低生产率仍然是制约其产业化生产的核心问题之一。至今对单体灵芝酸的积累过程及生物合成基因表达等尚缺乏深入的研究报道,了解和掌握相关信息对生产实践中有效提高活性产物的产量具有重要意义。据本实验室以往的报道,灵芝细胞两阶段培养(尤其是静置培养)是高效生产总灵芝酸的一种方法。因不同的单体灵芝酸具有不同的药理功能,掌握它们发酵过程中的积累规律具有重要的应用价值；同时为了探索灵芝酸生物合成的调控机制,我们考察了液体静置培养方式和传统振荡培养方式发酵中四种主要单体灵芝酸的积累,羊毛甾醇(中间代谢产物)和麦角固醇(副产物)的动态变化以及灵芝酸合成的三个关键酶——3-羟基-3-甲基戊二酰-乙酰辅酶A还原酶(HMGR),鲨烯合成酶(SQS)和羊毛甾醇合成酶(LS)基因的表达情况。结果表明在液体静置培养条件下单体灵芝酸的含量迅速增加并在发酵末期达到最大值,其含量分别为传统培养方式下的6-25倍。而中间代谢产物羊毛甾醇的积累则明显低于传统培养方式,表明在静置培养方式下可能更快的代谢为下游产物灵芝酸和麦角固醇。RT-PCR和荧光定量PCR的结果显示在不同的培养方式下三个关键合成酶基因的表达情况是不同的。与传统培养方式相比,液体静置培养模式下这三个酶的基因的转录水平分别上调了1.9,2.1和4.3倍,并且四种单体的积累与SQS基因的诱导表现为正相关关系。表明灵芝酸的高产和生物合成基因(尤其是SQS)的高表达是相关的。目前从羊毛甾醇到灵芝酸的代谢途径还不清楚,参与生物合成调控的其他因子也是未知的。分离和鉴定相关的基因,对于了解灵芝酸的生物合成途径、进一步探讨灵芝酸合成的调控机制及构建高产灵芝酸的工程菌株具有重要意义。为此,我们构建了灵芝细胞液体振荡培养和静置培养方式下的差异表达基因文库。利用cDNA宏阵列技术(macroarray),分别使用正向差减探针和反向差减探针筛选了差异表达克隆,从中获得了601个阳性克隆,序列测定及聚类分析后得到147个独立的表达标签序列(uniESTs)。RT-PCR对随机挑选的10个ESTs进一步验证的结果与macroarray结果一致。我们采用生物信息学的方法对这些基因进行了进一步分析,结果显示46个uniESTs代表了新的基因,它们与数据库中的核酸及对应的蛋白质序列均无显著的同源性；13个uniESTs对应的蛋白与已报道的假定蛋白有很高的相似性,其余88个与已知蛋白具有显著的同源性,它们分别与细胞代谢、蛋白合成、信号转导,转录调控等有关。这些差异表达基因的鉴定及其功能标释为我们深入了解灵芝细胞的分化和灵芝酸的合成调控提供了有益的信息。从灵芝细胞消减抑制杂交文库中我们筛选到了两个重要的真核细胞信号传导通路蛋白G蛋白p亚基(Gβ)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的ESTs序列,在丝状子囊菌中,相关的信号传导途径同时调节菌丝的分化和次级代谢产物的生物合成。考虑到它们在次级代谢调控中的重要性,我们采用RACE-PCR的方法克隆了这两个蛋白的全长cDNA序列。GβcDNA全长942bp,该基因编码313个氨基酸,与香菇的Gβ蛋白有91%的同源性。MAPK cDNA序列长1660bp,5’与3’非编码区长度分别为78bp和468bp,开放阅读框长度为1116bp,编码371个氨基酸,与褐腐菌Postia placenta的MAPK蛋白序列的同源性高达96%。本论文获得的灵芝细胞生产单体灵芝酸及调控次级代谢产物合成的分子机理信息,为深入研究灵芝酸的生物合成途径及分子多样性调节奠定了一定基础,同时相关的研究方法和思路对其他药用真菌培养生产有用次级代谢产物也有良好的借鉴作用。