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碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide，F2）是我课题组合成的一种新型钙拮抗剂，具有拮抗整体心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）和离体心肌细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤的作用，其主要机制包括抑制早期生长反应基因-1(early growth response gene-1，Egr-1)过表达、减轻氧化应激损伤以及拮抗钙超载等。近年来，转录因子 Egr-1被认为是 I/R损伤的共同分子基础，而大量研究也表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）所致的氧化应激在 I/R损伤过程中起着重要作用。鉴于Egr-1和ROS均与I/R损伤有着密切联系，结合我课题组前期在心肌细胞、心脏微血管内皮细胞中已证实存在ROS/MAPK/Egr-1通路，加之在心脏整体和离体I/R模型中发现，Egr-1反义寡核苷酸可以改善氧化应激损伤，我们认为心肌I/R时存在反向Egr-1/ROS通路，即Egr-1与ROS之间存在正反馈环路，二者互为上下游。据报道，沉默信息转录调控因子1（silent information regulator of transcription1，SIRT1）不仅与Egr-1具有相互作用，还能够通过多条途径下调ROS水平，因而可能介导了Egr-1/ROS信号通路。本研究通过RNA干扰技术沉默Egr-1，探讨H/R时心肌来源的H9c2细胞内是否存在Egr-1/ROS信号通路，研究SIRT1相关信号是否参与该通路，验证心肌I/R时ROS/Egr-1信号环路假说是否成立。并探讨F2是否通过调节ROS/Egr-1正反馈环路起到保护I/R心肌的作用。 方法： 1.制作H9c2细胞H/R模型，通过时效研究确定后续实验模型时间； 2.转染 Egr-1 siRNA沉默 H9c2细胞中 Egr-1基因：以倒置荧光显微镜、RT-PCR、western-blot确定转染效率，并选取最佳沉默序列进行后续实验； 3. Western-blot方法检测Egr-1 siRNA及F2对H/R时H9c2细胞中Egr-1的影响； 4.流式细胞仪检测Egr-1 siRNA和F2对H9c2细胞内ROS水平的影响，确定是否存在Egr-1/ROS信号通路； 5. Western-blot方法检测Egr-1 siRNA和F2对H9c2细胞内SIRT1及其下游Ac-FOXO1、FOXO1蛋白表达的影响； 6.免疫荧光共定位技术检测H/R时，Egr-1和SIRT1的表达及定位，探讨其是否存在共定位，并观察Egr-1 siRNA和F2对二者表达及定位的影响； 7.检测H9c2细胞中线粒体膜电位、GSH-px活力、T-SOD和Mn-SOD活力以及MDA含量，反映Egr-1 siRNA和F2对氧化应激损伤的影响。 结果： 1.通过倒置荧光显微镜、RT-PCR、western-blot确定Egr-1 siRNA转染成功且转染效率达90％； 2. H/R使H9c2细胞内Egr-1 mRNA和蛋白表达增加，ROS生成增多，Egr-1 siRNA能使H/R所致的Egr-1 mRNA和蛋白表达减少，ROS含量降低；F2也能使H/R所致的Egr-1蛋白表达减少，ROS含量降低； 3.各组间SIRT1蛋白表达无明显影响，差异无统计学意义（P>0.05）。H/R能够使H9c2细胞Ac-FOXO1蛋白表达增加，FOXO1蛋白表达降低，Egr-1 siRNA和F2均可抑制H/R所致Ac-FOXO1蛋白高表达，及FOXO1蛋白低表达； 4. Egr-1和SIRT1均主要表达于H9c2细胞细胞核中，各组荧光强度变化与western-blot所测蛋白水平变化趋势一致，H/R可增加Egr-1与SIRT1在空间结构上重合的可能性，而Egr-1 siRNA和F2可降低二者在空间结构上重合的可能性； 5. Egr-1 siRNA和F2可减轻H/R引起的H9c2细胞氧化应激损伤，升高线粒体膜电位，降低MDA含量，增加GSH-px活力，增加T-SOD和Mn-SOD活力。 结论： 1. H9c2细胞H/R时存在Egr-1/ROS信号通路，SIRT1/FOXO1/Mn-SOD信号于此通路中起了重要介导作用。结合前期实验结果：H/R可导致H9c2细胞ROS/Egr-1信号通路激活，表明心肌I/R时，存在ROS/Egr-1正反馈信号环路导致组织细胞损伤。 2. F2对H/R所致的Egr-1/ROS信号通路活化乃至ROS/Egr-1正反馈信号环路具有抑制作用，这是其拮抗心肌I/R损伤的一个重要机制。