目的：　　检测炎性因子IL-1β、TNF-α刺激肌腱干细胞后的炎性相关和成骨相关表达情况，并分析炎性因子与肌腱钙化的相关性，并进一步验证其信号通路。观察炎性因子是否促进肌腱干细胞的成骨分化，并构建肌腱干细胞炎性细胞模型，观察炎性肌腱干细胞和正常肌腱干细胞成骨分化的差异，探究炎性因子在肌腱钙化中发挥的作用，研究肌腱钙化发生的可能细胞分子生物学机制。　　方法：　　1.肌腱干细胞的分离培养与鉴定。观察肌腱干细胞的细胞形态和克隆形成能力；体外验证肌腱干细胞的多向分化能力，分别对肌腱干细胞进行成骨、成脂肪诱导；流式细胞术对干细胞特异的表面标志抗原进行检测。　　2.首先观察单纯炎性因子是否诱导肌腱干细胞成骨分化。细胞分组培养，加入含有20ng/ml IL-1β、100ng/ml TNF-α的Lg-DMEM完全培养基培养，分别为对照组、IL-1组、TNF-α组。ELISA检测不同炎性因子浓度、不同刺激时间分泌PGE2的情况；qRT-PCR检测炎症相关基因以及肌腱、成骨相关基因的表达，Western Blotting检测相关蛋白的表达。其次，每组额外添加成骨诱导因子BMP-2，观察炎性因子是否促进肌腱干细胞成骨分化，及并通过炎性因子刺激构建炎性肌腱干细胞模型，观察炎性肌腱干细胞和正常肌腱干细胞在成骨分化方面的差异。　　3.炎性因子促进肌腱干细胞成骨分化的细胞信号通路的初步研究。同上，分为对照组、IL-1β组、TNF-α组，细胞经培养7天后，通过qRT-PCR技术对基因NF-κB进行检测。选择100ng/ml TNF-α加入Lg-DMEM完全培养基培养，以刺激培养3天、7天及14天分为三组，Western Blotting检测不同时间蛋白NF-κB及炎症相关蛋白Cox-2的表达，并分析其相关性。　　结果：　　1.利用胶原酶消化分离法和低密度接种法，从正常肌腱组织分离出细胞，其中约有0.8%-1.2%的细胞形成单细胞克隆。体外成骨诱导21天后，茜素红染色显示肌腱干细胞被诱导成功，形成钙盐结节；体外成脂诱导21天后，油红O染色可见红色脂滴。流式结果显示超过99%和92%的细胞干细胞表面标记物CD105、CD44，只有0.10%和0.25%的细胞表达造血系统表面标志物CD14、CD45。　　2.ELISA检测结果显示，PGE2与炎性因子刺激之间存在着剂量依赖性和时间依赖性，随着浓度的加大和时间的延长而分泌增多。q RT-PCR检测显示，炎性相关基因Cox-2、MMP-1以及成骨相关基因Runx2、BMP-2的水平较正常对照组均上调，TNF-α组较IL-1β组上调明显。Western Blot检测显示蛋白Cox-2、Runx2亦有上述类似结果。肌腱相关基因ColⅠ、TNC的表达情况相对复杂，IL-1β刺激下，下调了ColⅠ水平，却上调了TNC水平；TNF-α刺激下，下调TNC的水平不如IL-1β明显，但同时下调了ColⅠ水平。Western Blot检测结果显示：炎性因子IL-1β、TNF-α刺激肌腱干细胞后，三个时间点蛋白Runx2呈低程度表达，但高于对照组；炎性肌腱干细胞较正常肌腱干细胞在促进成骨分化方面，具有一定优势。经培养7天后，镜下观察IL-1β组和TNF-α组开始发现钙盐沉积；14天后，在茜素红S染色实验中发现对照组基本无钙盐沉积，IL-1β组和TNF-α组已经出现了红色钙盐沉积。　　3.qRT-PCR和Western Blot结果显示，与对照组相比，炎性因子刺激均可增加NF-κB的mRNA水平和蛋白表达。且随着时间的延长，蛋白Cox-2、NF-κB的表达逐渐增加。　　结论：　　1.利用胶原酶消化分离法和低密度接种法可成功从人正常肌腱组织中分离出干细胞。　　2.炎性因子促进肌腱干细胞成骨分化。肌腱炎症反应，可能是肌腱钙化形成的诱因。肌腱干细胞受该刺激后，通过分泌Cox-2、PGE-2和MMP-1等炎性因子，引起高表达非肌腱细胞相关基因、蛋白，如Runx2、BMP-2，从而调控肌腱干细胞成骨分化，这些异常分化的累积导致细胞内基质退变，进而出现钙化灶等肌腱钙化的病理改变。同时，炎性肌腱干细胞的发现，为今后肌腱钙化的细胞机制研究提供了基础条件。　　3.炎性因子TNF-α促进肌腱干细胞NF-κB的表达，这可能是炎性因子诱导肌腱干细胞成骨分化的细胞信号通路之一。