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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为革兰氏阳性菌,是一种重要的食源性致病菌。广泛存在于自然界中,空气、土壤、水及食具上均有分布。食用被该菌污染的食物可能会引起全身非特异性炎症反应,如可引起恶心、呕吐、恶寒、胃部痉挛、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等疾病,严重时甚至会导致败血症、脓毒症等全身性感染,对人类的健康造成极大地潜在威胁。噬菌体作为一种新型的生物制剂,具有专一性强、安全性能高、不易产生抗性的特点,可以用于金黄色葡萄球菌的生物防控。 为了探索行之有效的控制金黄色葡萄球菌的方法,本研究以金黄色葡萄球菌ATCC6538为宿主菌,从污水中分离纯化出一株强裂解性噬菌体qdsa001,并研究了其生理生化特性及应用,为噬菌体应用于生物防控奠定了基础。 1、以金黄色葡萄球菌ATCC6538为宿主菌,利用双层琼脂平板法从污水样品中分离得到一株噬菌体,命名为qdsa001,增殖后该噬菌体的效价较高,能达109pfu/ml以上。噬菌斑的形态和大小均匀一致,呈圆形透明,边缘清晰,直径约为1mm,噬菌体效价高,体外裂解能力强,是一株特异性强的裂解性噬菌体,可以为后续工作提供良好的试验材料。 2、通过电镜观察显示,该噬菌体呈蝌蚪形,头部为正多面体结构,有细长的尾部,整个噬菌体大小约为220nm左右,尾部长约180nm左右,符合长尾噬菌体科(Siphoviridae)特征,为长尾噬菌体。对噬菌体qdsa001核酸基因组的提取和鉴定表明其基因型为DNA。 3、对噬菌体qdsa001的生理生化特性进行测定,结果表明:该噬菌体对热的稳定性较高,对60℃以下的温度耐受力较强;对70℃及其以上的高温非常敏感,在该温度下噬菌体基本上失去活性;对pH值的适应范围较宽,在pH值5~9的范围内均能保持较高的裂解活性,最佳pH值在7左右,当pH低于3时,噬菌体失去裂解活性;最佳感染复数为0.1,感染宿主菌的潜伏期约为10min,裂解期约90min。裂解量为32.2。 4、噬菌体qdsa001对牛奶中的金黄色葡萄球菌具有良好的抑制效果。37℃作用12h后可以使牛奶中的金黄色葡萄球菌浓度从105cfu/mL降低至检测限以下。于4℃条件下作用24h可以使105cfu/mL的金黄色葡萄球菌数量减少2.5log,作用72h后可以使金黄色葡萄球菌浓度从102cfu/mL降低至检测限以下。 5、将该噬菌体应用于噬菌体微胶囊化应用,利用海藻酸钠为璧材,采用挤压法将噬菌体进行包埋得到噬菌体微胶囊,通过优化实验得到了最佳工艺参数:海藻酸钠浓度为2.2%、氯化钙浓度为200mmol/L、脱脂奶粉浓度为4.0%,此时噬菌体的包埋率最高约50%,对胃模拟液的强酸环境的耐受能力显著增强。 6、噬菌体对甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌(MSSA)ATCC6538和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)ATCC43300均具有裂解活性,对其所形成的细菌生物膜具有抑制作用。噬菌体对由ATCC6538所形成的生物膜作用24h后,对生物膜的抑制率约为90%;对由ATCC43300所形成的生物膜作用24h后,对其抑制率也在77%左右。同时,通过扫描电镜观察也表明噬菌体对以上两种金黄色葡萄球菌所形成的生物膜均具有良好的抑制效果。 综上所述,本试验分离得到的噬菌体qdsa001裂解能力较强,可以裂解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,对理化因素的耐受力较强;通过微胶囊化对噬菌体进行包埋,可以提高其对酸的耐受力。同时,该噬菌体可以有效的抑制细菌生物膜,并且对牛奶中的金黄色葡萄球菌也具有良好的抑制作用。