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本文从大型白腐菌的一类——食用菌中来筛选高产漆酶的菌株，用不同底物、不同浓度、不同培养时间、不同培养基，进行了漆酶产生菌株筛选条件的研究，获得了高产漆酶的微生物菌株香菇 Cr8001、Cr241、As5.531。然后选取筛选到的香菇 Cr241 为供体菌，用 RT－PCR 的方法对漆酶基因进行克隆，得到一长度为 112bp 的漆酶基因片段。 本文研究所采用的方法步骤及所得出的结论如下：（1）选取了74个菌株作为出发菌株用Bavendamm氏反应培养基进行初 筛，包括平菇 36 株、香菇 25 株、草菇 3 株、杏鲍菇 3 株，其他 类 7 株，在 PDA 固体培养基中加入 0.4mM 的单宁酸，28℃培养 6d 后，根据是否显色及显色圈的大小初步筛选得到 19 个漆酶高产菌 株。（2）对初筛得到的 19 个漆酶高产菌株用氧化带测量的方法进行筛选 验证，PDA 固体培养基中加入 0.02％、0.04％、0.06％的愈创木 酚倒平板，在平板中央接种 8d 菌龄、直径 12mm 的菌塞 1 个，28 ℃培养并记录氧化带变化情况，结果表明愈创木酚加入量为 0.04 ％时最易于筛选漆酶高产菌株，筛选得到漆酶高产菌株 14 个：农 平 3 号、农大 1 号、推广 1 号、冀 11、Cr 26、 Cr 241、Cr 8001、 Cr 135、As 5.560、As 5.417、As As5.531、杏鲍菇 1 号、羊肚 菌和广草。（3）对经过初筛和氧化带筛选验证得到的 14 个漆酶高产菌株用液体发 酵培养酶活测定，每 250ml 三角瓶装入 30mlPDA 液体培养基，接 入 8d 菌龄、直径 12mm 的菌塞 3 个，测定酶活，得到培养 20d 后可达产酶高峰期的高产漆酶菌株香菇 Cr241、Cr8001 和 1<WP=8>河南农业大学 2004 届硕士论文 As5.531。（4）选取筛选得到的漆酶高产菌株香菇 Cr241 为供体菌，用 RT－PCR 的方法对漆酶基因片段进行克隆，RT－PCR 反应体系为 50μl ：20 ×Buffer (无 Mg2+)1.5μl；Mg2+(25mmol/L) 1μl；dNTP(2.5mmol/L) 0.5μl；RT-PCR 酶混合物 1μl；上游引物(2.5μmol/L)2μl；下 游引物(2.5μmol/L) 2μl；Oligo dT2μl；mRNA 模板 1～100ng； 无菌双蒸水 20μl；石蜡油 25μl。反转录（RT）的条件为：37℃， 30min。PCR 的条件为：① 94℃ 10min 1 cycle；② 94℃ 1 min、62.5℃ 2 min 、72℃ 3 min 30 cycles；③ 72℃ 10min 1 cycle；④ 4℃ 5min。得到长度为 112bp 的目的漆酶基因片段。