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朵丽蝶兰(Doritaenopsis)由蝴蝶兰(Phalaenopsis)与朵丽兰(Doritis)杂交而成属于广义上的蝴蝶兰,由于其花色艳丽,花期持久,因而深受消费者欢迎,市场占有率高,具有较高的观赏价值和经济价值。本研究通过在Hong-Hwa Chen建立的OrchidBase的cDNA文库中的EST序列进行比对分析,筛选出两个与玉米(Zea mays)中EFL4同源性很高的序列,以出瓶7 个月左右的朵丽蝶兰’Tinny Tender’(Doritaenopsis Happy smile × Happy valentine)克隆苗为试材,利用RACE技术分离基因的cDNA序列,并通过转基因进行功能验证。同时利用染色体步移技术获得DhEFL4启动子序列。取得的主要研究结果如下:1、利用RACE的方法克隆到了朵丽蝶兰中DhEFL4基因的cDNA序列,其中,获得了DhEFL 基因的cDNA序列593bp bp,含有一个345 bp的ORF区,编码114个氨基酸。2、通过由处于光照进入黑暗时分朵丽蝶兰的根、茎、叶、花梗、花蕾及花器官(花瓣、萼片、唇瓣和蕊柱)进行实时定量PCR,发现花蕾的表达量最高,说明DhEFL4和朵丽蝶兰成花相关。同时分别采集短日照和长日照处理条件下朵丽蝶兰的叶片(一昼夜中每隔两小时采集一次),将长日照和短日照的叶片分别进行实时定量PCR,建立了DhEFL 基因的昼夜节律,结果显示DhEFL4基因具备明显又规律的昼夜节律性,而且长、短日照下的表达规律不同,说明日照时间还是会影响到朵丽蝶兰的成花,即使朵丽蝶兰是光钝感植物。3、以pCAMBIA1301为植物表达载体,pMD20-T为中间载体,构建了 PC1301-DhEFL4正义表达载体。4、采用蘸花法侵染拟南芥,利用潮霉素筛选纯合子并观察其表型变化,结果表明,DhEFL4转基因植株的开花时间有很明显的延迟,并且抽葶数增加,在DNA和RNA水平上均能检测到相应基因在转基因植株体内的表达,这一结果与拟南芥中的报道基本一致,可推测DhEFL4基因也是通过光周期途径调控朵丽蝶兰成花。5、获得DhEFL4 ATG前2604bp序列,经过PLACE、Plant care启动子专业软件的分析,发现序列中包含了 TATA、CAAT、Circadian等一系列元件。