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前言吸烟是动脉粥样硬化的主要危险因素,对于人类在心血管方面的危害超过了吸烟导致的肺癌。我国是世界上烟草消耗最大的国家,国人60%男性和3%女性吸烟,吸烟者大约有3.5亿人。吸烟对人类健康的危害是巨大的,2000年世界上有169万人因吸烟死于心血管疾病,占全球心血管疾病死亡人数的11%,2002年有500万人的死亡是由吸烟引起的,而我国每年有120万人因吸烟导致死亡。碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)是肝素结合生长因子家族成员之一,在体内分布广泛。bFGF具有多种生物学特性,促进细胞增殖是其主要作用之一。而血管平滑肌细胞增殖(vascular smooth muscle cell, VSMC)是动脉粥样硬化、再狭窄和肺动脉高压等多种心血管疾病的病理基础。本研究应用烟草烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激体外培养的大鼠VSMC,观察其对大鼠VSMC增殖的影响并应用bFGF抗体中和bFGF生物功能,探讨bFGF在CSE刺激VSMC增殖中的作用机制。实验方法一、大鼠主动脉血管平滑肌细胞培养细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱中静置培养,每2天换液1次。当细胞长满瓶底80%左右时,用0.25%胰蛋白酶消化传代。取第3-8代的细胞,当细胞长至70%-80%融合时进行实验。二、实验分组1、用不同浓度(0,2.5%,5%,10%,20%)CSE刺激VSMC,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)观察细胞增殖变化,免疫细胞化学法测定bFGF和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)蛋白的表达,同时用RT-PCR检测bFGF mRNA表达。2、用筛选出的最适CSE浓度处理VSMC不同时间(Oh,4h,8h,12h,24h)后,检测bFGFmRNA, bFGF和PCNA蛋白的变化。3、用bFGF抗体和最适浓度CSE干预VSMC 24h后检测细胞增殖,bFGF和PCNA蛋白表达的变化。三、实验检测方法噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]比色法测定VSMC的增殖；用免疫细胞化学法测定bFGF, PCNA蛋白的表达；用RT-PCR检测bFGF mRNA表达的变化。实验结果1、与对照组相比,低浓度(2.5%)CSE组(P<0.05)和中浓度(5%)CSE组增加明显(P<0.01),而高浓度(10%CSE)或过高浓度(20%CSE)组与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。bFGFmRNA、蛋白和PCNA蛋白在对照组中有少量表达。与对照组相比,2.5%CSE组表达增加(P<0.01),5%CSE组达到高峰。10%、20%CSE组仍高于对照组(P<0.01)。2、对照组(不加CSE组即Oh组)VSMC中有少量bFGF mRNA、蛋白和PCNA蛋白表达。5%CSE刺激4h后细胞内bFGF mRNA、蛋白和PCNA蛋白表达增加(P<0.01),bFGFmRNA于8h达高峰；bFGF和PCNA蛋白于12h达高峰。3、bFGF抗体可显著抑制5%CSE诱导的MTT吸光度(A值)和bFGF、PCNA蛋白表达增加。结论CSE可能是通过增加bFGF的表达促进大鼠VSMC的增殖。