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目的:采用RNA-Seq技术检测电针俞募配穴治疗功能性腹泻大鼠的空肠及海马差异基因,并使用qRT-PCR检测方法验证差异表达基因,研究电针俞募穴治疗功能性腹泻大鼠的作用机制。方法:1.建立功能性腹泻大鼠模型与穴位效应观察:选用30只8周龄雄性SD大鼠,SPF级,采用SPSS制作的随机数字表将其随机分为5组:募穴组、俞穴组、俞募穴组、空白组和模型组。用0.3g/ml的番泻叶药液灌胃以建立功能性腹泻大鼠模型,电针组及模型组每日用番泻叶药液灌胃一次,连续十天;空白组大鼠则使用等量0.9%生理盐水灌胃。每次灌胃1小时后,对各组进行干预。俞穴组干预方式为电针大肠俞穴,募穴组干预方式为电针天枢穴,俞募穴组干预方式为电针大鼠天枢穴及大肠俞穴,每次20分钟;模型组和空白组作为对照,均不予针刺,仅捆绑20分钟,每日1次;共10次。干预结束后,观察并记录各组大鼠一般情况、24h排便粪粒数、24h粪便含水量。2.差异表达基因分析:选用30只8周龄雄性SD大鼠,SPF级,将其随机分为5组:募穴组、俞穴组、俞募穴组、空白组和模型组。干预措施同前,干预结束后取材。随后对各组大鼠空肠和海马组织进行RNA-seq测序,并对测序筛选出的显著差异基因进行GO功能富集分析、pathway富集分析。3.定量反转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测:根据基因测序结果,筛选差异表达基因进行PCR验证。结果:1.模型组大鼠与空白组相比,排便粒数明显增多,具有统计学差异(P<0.05)。俞募穴组大鼠与模型组大鼠相比,排便粒数明显减少,具有统计学差异(P<0.05),俞穴组及募穴组大鼠24小时粪便粒数较模型组无明显差异。模型组含水量较空白组显著升高,具有统计学差异(P<0.05),俞募组和募穴组较模型组含水量显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而俞穴组粪便含水量与模型组相比无明显差异。2.俞募配穴治疗功能性腹泻大鼠空肠组织差异基因表达分析:(1)与空白组相比,模型组中显著性差异基因78个,下调基因27个,上调基因51个。GO功能富集和Pathway的富集结果表明,功能性腹泻大鼠空肠的差异表达基因主要体现在对消化系统的合成和代谢的影响:影响脂类代谢;矿物质结合、转运和吸收;蛋白质合成与代谢;影响胆汁分泌、补体系统等信号通路(P<0.05)。(2)与模型组相比,俞募组中显著性差异基因8个,下调基因1个,上调基因7个,GO功能富集在分子功能上主要富集在氧化还原酶活性,参与的生物过程显著富集在药物反应、节律进程。Pathway显著性富集在节律等通路(P<0.05)。(3)与模型组相比,募穴组中显著性差异基因57个,下调基因33个,上调基因24个,GO功能富集结果表明差异表达基因在显著富集在细胞外,在分子功能上主要富集在生长因子结合,生物过程显著富集在节律进程。在Pathway分析中发现差异基因富集在血管平滑肌收缩等通路(P<0.05)。(4)与模型组相比,俞穴组中显著性差异基因49个,下调基因25个,上调基因24个,GO功能富集结果显示差异表达基因在显著富集在细胞内核糖体,在分子功能上主要富集在铁离子结合、血红蛋白结合、抗氧化活性、转换金属离子结合,参与的生物过程显著富集在氧代谢过程、蛋白质合成与代谢等通路(P<0.05)。3.俞募配穴治疗功能性腹泻大鼠海马组织差异基因表达分析:(1)模型组大鼠与空白组大鼠显著性差异基因13个,下调基因9个,上调基因4个,GO功能和Pathway均无显著性富集(P>0.05)。(2)与模型组相比,俞募组显著性差异基因5个,下调基因4个,上调基因1个,GO功能富集分析主要涉及分子功能受体结合,Pathway无显著性富集(P<0.05)。(3)与模型组相比,募穴组显著性差异基因22个,下调基因2个,上调基因20个,GO功能富集结果显示差异表达基因主要位于细胞外,涉及分子功能包括G蛋白耦联受体结合,受体结合,参与的生物过程包括神经系统进程,Pathway无显著性富集(P<0.05)。(4)与模型组相比,俞穴组显著性差异基因5个,下调基因1个,上调基因4个,GO功能和Pathway均无显著性富集(P>0.05)。4.qRT-PCR基因定量结果:大鼠模型组和俞募组空肠组织AQP8、Htra2、NOD2三个目的基因RNA-seq结果和qRT-PCR结果相比较,将俞募组与模型组表达量的比值作为差异倍数,结果发现,AQP8、Htra2、NOD2等三个基因变化趋势一致,显示RNA-seq结果质量较好。结论:1.针刺大肠俞募穴可以改善功能性腹泻大鼠肠道动力亢进,降低大鼠排便量和粪便含水量。2.电针俞募配伍治疗FD空肠位点效应机制:(1)俞穴治疗FD局部效应不明确,整体功能分布较散乱,靶向性不明确;(2)募穴治疗FD局部效应肯定,通过下调肌球蛋白和肌动蛋白相关基因表达,调整功能性腹泻大鼠肠道动力亢进状态(3)俞募组治疗FD效应可能是由于多巴胺能神经突触通路影响离子通道蛋白改变突触传递功能,进而调节功能性腹泻大鼠肠道动力亢进的状态。3.电针俞募穴配伍治疗FD海马效应机制可能与压力信号通路相关,但仍需进一步验证。