Ran(Ras-like nuclear protein)是一种在真核生物中高度保守的小分子GTPase蛋白,属于小G蛋白家族。Ran蛋白与不同的调节因子和辅助因子相互作用,参与核膜重建、纺锤体的组装、DNA复制、细胞周期的调节和核质间物质的运输等。Ran蛋白在其辅助蛋白的调控下进行RanGTP和RanGDP两种结合态之间不断循环转变,表现出功能的多样性。　　染色体浓缩调节因子RCC1(regulator of chromosome condensation1)是唯一已知的Ran的鸟嘌呤核苷酸交换因子,含有保守的RLD(RCC1-like domain)结构域,与Ran蛋白结合,促进Ran-GDP转变为RanGTP结合态,从而促进核质运输,同时在染色体端粒沉默、细胞周期的调控和微管的组装发挥重要功能。　　嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种营自由生活的淡水单细胞原生生物,具有核的二态性,即含有多倍体的体细胞大核和二倍体生殖小核。生殖方式主要有无性生殖和有性生殖两种方式。无性生殖时期,大核无丝分裂而小核进行有丝分裂;有性生殖时期,小核进行减数分裂和有丝分裂后进行核的交换进而形成合子核,产生新的大核和小核而旧大核降解。嗜热四膜虫细胞中核结构精细动态的变化使其成为研究细胞核结构和发育的良好模式生物。本课题组先前研究表明嗜热四膜虫中 Ran和 RanBP1蛋白调控了大核的无丝分裂,它们的异常表达会使细胞增殖速度变慢,但至今还没有发现关于嗜热四膜虫中RCC1蛋白的相关研究。　　本研究首次从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出一个新的 RCC1基因,并在生物信息学水平和细胞分子水平进行了分析,研究结果如下:　　1.生物信息学分析通过同源序列比对,我们从四膜虫基因组数据库(http://www.ciliate.org)鉴定了人的 RCC1同源物 TTHERM_00530380基因,该基因全长2541 bp,开放阅读框2181 bp,预测编码726个氨基酸。对其氨基酸序列分析发现RCC1含有一个RLD结构域,将其编码基因命名为四膜虫RCC1。Real-time PCR检测RCC1的转录水平,发现RCC1在嗜热四膜虫不同细胞周期中都有表达,并在有性生殖时期表达水平达到最高。本研究结果与四膜虫功能基因组数据库(http://tfgd.ihb.ac.cn)中该基因的microarray表达谱相一致,进一步证实了RCC1在四膜虫发育过程中的动态表达。聚类分析表明 RCC1分子进化和物种进化相一致,表明了在生物进化过程中,RCC1蛋白具有保守的功能。　　2. HA-RCC1的细胞定位构建含有 HA标签的重组质粒 pXS75-RCC1,将pXS75-RCC1转入野生型的B2086和Cu428四膜虫细胞中,通过同源重组RCC1基因替代MTT1基因,RCC1在Cd2+诱导下受到MTT1基因启动子的调控,梯度增加巴龙霉素浓度筛选突变体细胞株,通过PCR鉴定获得整合HA-RCC1基因的突变体细胞株。HA单克隆抗体免疫荧光定位分析表明,在营养生长期,HA-RCC1特异地定位于大核和小核,饥饿时期同样定位于大核和小核中,在有性生殖时期,亲本大核和小核仍有定位。此外 RCC1还定位于降解的旧大核上,直到亲本大核完全降解,表明RCC1是细胞核特异的功能因子。　　3. RCC1的过表达影响细胞核分裂在MTT1启动子调控下的HA-RCC1基因,通过不同浓度的Cd2+诱导,实现HA-RCC1基因的过表达。通过DAPI染料对过表达RCC1的细胞株中的细胞核进行染色,观察细胞核分裂的过程。分析过表达HA-RCC1对细胞发育的影响,结果显示 RCC1过量表达导致细胞中大核无丝分裂异常,进而抑制了大核的无丝分裂,最终产生部分无大核的异常细胞。　　4. RCC1的敲减引起小核异常分裂为了进一步分析RCC1的功能,构建了RCC1基因敲除质粒pNeo4-RCC1,pNeo4-RCC1转化野生型四膜虫细胞,通过巴龙霉素浓度梯度筛选,细胞表型分配获得 RCC1基因敲减突变体细胞株。结果表明 RCC1基因对后代的发育是必须的。进一步分析RCC1敲减对细胞发育的影响,DAPI染色敲减 RCC1细胞株,观察细胞核分裂的过程,发现发育的细胞中产生多个小核,大核无丝分裂受到抑制,而且抑制了细胞增殖速率。　　总之,本研究首次从嗜热四膜虫中鉴定出一个新的RCC1基因,RCC1的异常表达影响了细胞正常的核分裂,这种异常表型与Ran1的突变体GTP锁定态和GDP锁定态、异常表达RanBP1的表型是一样的,暗示RCC1可能通过改变Ran-GTP的浓度梯度,进而影响细胞的核发育。RCC1的正常表达对嗜热四膜虫细胞的增殖过程起到重要的调控作用。