背景:胃癌(Gastric cancer,GC)目前在全球范围内恶性肿瘤发病率居第五位,在癌症相关死亡中排列第三位,我国是GC的高发及高死亡率国家。由于GC早期症状不明显,晚期无法行手术治疗,化疗及靶向药物的耐药性等因素,均会影响治疗效果。近年来,中医药以其低副作用及配合化疗药的增效减毒作用引起了广泛性的关注,从中医中药角度寻求减毒增效的治法方药成为了人们研究的热点和方向。全国名老中医、南京中医药大学刘沈林教授在多年临床工作中总结的益气健脾化积方,为治疗GC的经验效方,此方临床应用多年,疗效得到认可,与化疗药物配合具有一定的增效减毒作用。该方作用以补益为主,并兼以化积消瘀;方剂立法予补中有泻,虚实同治,辨病辨证相合,体现了“病证合一”的治疗原则。为进一步评价该方对化疗的增效减毒作用,并探索其部分作用机理,且为临床应用提供理论及实验依据,本论文分从理论文献、临床疗效评价和体内外实验等三个方面进行了相关研究。第一部分:理论研究首先从现代医学角度对GC的流行病学、危险因素、发病过程与分期、诊断现状、个体化预防和治疗现状进行了概述分析,文献研究总结表明,对早期GC的及时手术治疗,能有效切除病灶,控制进展和扩散。传统的化学疗法和新兴的靶向药物疗效肯定,但有研究认为,积极的术后辅助放化疗和多药联合化疗,其生存期无明显改善;靶向药物的单一靶点和耐药性均一定程度上影响了GC内科治疗的效果;化学药物引起的毒副作用以及产生的免疫抑制也制约着治疗过程的正常进行。因此,寻求能提高化疗效果、减轻毒副作用的新的治疗方法和药物已成为人们重点研究的目标之一。新近研究发现,TGF-β、NF-κB、Wnt、Notch等信号通路和细胞凋亡关系密切,特别是NF-κB信号通路被激活后可控制GC起始和进展的多个方面。有效的NF-κB抑制剂的应用或研制可对NF-κB活性进行选择性调控,给GC的诊断和靶向治疗带来新的突破,亦给GC的治疗带来新的前景。中医文献研究表明,GC的发病以脾虚为基础,因气郁、痰凝、血瘀、癌毒互结胃腑所致;主要病机则为脾胃亏虚,邪毒内干;多以补脾益气为其基本治法,辩证加以疏肝理气、或活血化瘀、或化痰散结、或清热解毒等法。众多研究显示,中医药在改善GC患者临床症状和生存质量、减轻化疗毒副作用、提高化疗药物效果、调节免疫力、抑制GC生长及转移等方面显示出综合优势。大多学者认为,中医药方法及中西医结合疗法、或中西医药联用可能是未来治疗GC的重要途径和方法之一。第二部分:临床研究目的:观察益气健脾化积方(YJHF)配合化疗对GC的临床疗效,评价其增效减毒作用及免疫调节作用,为临床推广应用提供客观依据。方法:①按GCP规范,采用多中心,双盲,随机,单模拟平行对照的试验设计方法,分5个中心收集中晚期GC化疗患者100例(自愿受试),按盲法编码分配。②分为试验组(YJHF+DC化疗方案)和对照组(YJHF模拟剂+DC化疗方案)。5个时间窗(Day0、15、29、43、57)观察2个化疗周期期间的临床疗效(包括近期客观疗效、生活质量、体力状况以及中医证候积分)、毒副作用(血液学和非血液学)以及免疫指标(外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞)。结果:①共搜集病例93例,实际观察有效完整病例85例患者(脱落15例,脱落率<20%)。②揭盲后显示,其中试验组44例(脱落3例),对照组41例(脱落5例)。两随机组在年龄、性别、家族史、手术史、化疗史、分期等无显著差异(P>0.05),具有可比性。③临床受益率:试验组和对照组分别为90.91%、75.61%,比较有显著优势(P<0.05)。④中医证候疗效:试验组总有效率93.18%,对照组总有效率70.73%(P<0.05)。⑤中医症状积分:试验组主症的积分较治疗前改善为75.57%,Day57试验组积分明显改善,优于对照组(P<0.05),尤其是食少纳呆、体倦乏力、嗳气反酸、消瘦等症状的改善差异明显。⑥体力状况和生活质量:从Day43开始,试验组显著优于对照组(P<0.05)。⑦试验组的化疗副作用(转氨酶升高、便秘、呕吐、厌食、脱发、腹痛)明显少于对照组(P<0.05)。⑧治疗前后比较,T细胞亚群治疗组呈现免疫调节趋势,趋势较对照组明显,但无统计学意义;而试验组NK细胞水平明显高于治疗前和对照组(P<0.05)。结论:中药复方YJHF可以提高近期客观疗效,改善生活质量、体力状况以及中医症状和体征评分,减少GC化疗的副作用。YJHF在免疫调节中起一定作用,可通过稳定机体的免疫功能来提高GC治疗的效率。本研究表明YJHF配合化疗具有增效减毒的作用。第三部分:实验研究实验一:体外细胞试验目的:探讨益气健脾化积方(YJHF)对人胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:采用0、30、60、90、120和150 μg/mL的YJHF作用于BGC-823细胞24h后,应用MTT法检测细胞的增殖情况,应用流式细胞仪检测细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞中caspase 3、Bcl-2及NF-κB信号通路相关基因和蛋白的表达水平。结果:①细胞形态学观察,YJHF作用于BGC-823细胞后,出现了细胞皱缩,细胞形态不规则改变等细胞凋亡的表现。②MTT检测提示YJHF对BGC-823细胞干预24h后,具有明显的浓度依赖性抑制增殖作用,120、150μg/mL浓度有统计学意义(P<0.05),IC50=100.80μg/mL。③流式细胞术检测结果显示,YJHF可促进BGC-823细胞的凋亡,在90ug/mL(P<0.05)、120ug/mL及150ug/mL(P<0.01)浓度的细胞凋亡率显著性升高,并呈明显的浓度依赖。④Western blot检测结果表明,YJHF使BGC-823细胞处于凋亡状态,与对照组相比,YJHF 120ug/mL、150ug/mL(P<0.01)浓度的Caspase 3表达明显降低,YJHF 150ug/mL(P<0.01)浓度的Bcl-2表达明显降低。⑤NF-κB信号通路相关蛋白表达结果显示,YJHF 150ug/mL浓度的NF-κB蛋白表达降低,120ug/mL、150ug/mL浓度的IKBα、p-IKBα及IKKα蛋白表达降低,90ug/mL浓度的p-IKBαα蛋白表达降低,与对照组比较具有显著差异(P<0.05/0.01)。Q-PCR结果显示YJHF 120ug/mL和150ug/mL浓度的NF-κB mRNA表达明显降低,60ug/mL、150ug/mL浓度的IKBα mRNA表达明显降低,与对照组比较具有显著差异(P<0.05/0.01)。结论:当YJHF药物浓度大于90μg/mL时,可抑制人胃癌BGC-823细胞增殖,促进凋亡。YJHF阻断NF-κB进程,抑制胃癌BGC-823细胞增殖的机制是通过下调NF-κB的表达,触发下游外源性Caspase 3剪切和内源性Bcl-2表达,从而导致细胞凋亡。本研究表明,YJHF可通过抑制NF-κB信号通路表达促BGC-823凋亡。实验二:体内动物实验目的:探讨益气健脾化积方(YJHF)配合化疗药顺铂协同促进GC细胞凋亡,干预肿瘤增殖、发展及作用的可能机制。方法:建立人GC裸鼠荷瘤模型,分模型组(M组)、顺铂组(C 组)2mg·kg-1 ip、顺铂+YJHF(高剂量62.31g·kg-1 中剂量41.53g·kg-1,低剂量20.77g·kg-1)共5组,除M组,分别予顺铂2mg·kg-1腹腔给药2次/周,C组予生理盐水灌胃,中药组加用不同浓度的YJHF灌胃干预,共3 1天。观察干预前后裸鼠体重、生存时间、肿瘤大小的变化情况。运用HE染色、Tunel法、Western blot和Q-PCR等技术,检测移植瘤组织中凋亡情况、NF-κB相关蛋白及mRNA的分布和表达变化情况。结果:①荷瘤裸鼠体重:YJHF联合顺铂作用于人GC荷瘤裸鼠,可减缓顺铂对于荷瘤裸鼠体重下降的影响,组间差异不大(P>0.05)。②瘤体变化:Day7时C+YJHF中、高剂量组瘤体与M组相比即出现差异(P<0.05),Day13时与C组相比开始有明显差异(P<0.05)。抑瘤率:C组和C+YJHF低组相似,YJHF中剂量及高剂量组明显升高,高达50%以上。③瘤内细胞变化:瘤组织BGC-823细胞数量随中药浓度而递减,排列稀松,可见片状坏死等凋亡的表现,Tunel法也可观察到瘤组织内细胞凋亡,C+YJHF中、高组的凋亡指数明显高于M和C组(P<0.05)。④YJHF浓度依赖性地降低Caspase3和Bcl-2蛋白在肿瘤组织中的表达,YJHF高组明显较C组降低(P<0.05/0.01);YJHF可升高Bax的表达,与C组相比升高,YJHF中组较M组升高明显(P<0.05)。⑤YJHF浓度依赖性降低肿瘤组织中IKK-β、NF-κB、p-IKB-α蛋白表达,YJHF高组较M和C组降低(P<0.01),YJHF中组较M组降低(P<0.05);YJHF浓度依赖性降低p-NF-κB、IKB-α、IKK-α蛋白表达,YJHF高组较M和C组降低,与M组差异明显(P<0.05);YJHF浓度组间比较,YJHF高组p-IKB-α蛋白表达低于YJHF低组(P<0.05)。Q-PCR显示与M组相比,C+YJHF中组(P<0.05)和C+YJHF高组(P<0.01)的NF-κB mRNA表达明显降低。C+YJHF低、中、高组的IKKα和IKBα mRNA表达与C组相比均明显降低(P<0.05),更低于M组。结论:YJHF能够配合顺铂化疗抑制GC组织生长,并提示YJHF可能是通过减少NF-κB活化,阻断了NF-κB抗凋亡通路,使GC细胞凋亡增加,提高了化疗疗效。结合裸鼠一般状况,YJHF中剂量效果最佳。本研究表明,①益气健脾化积方能够改善GC化疗患者生活质量和体力状况积分,提高患者机体免疫功能,一定程度上减轻GC化疗的毒副反应;益气健脾化积配合化疗具有一定的增效减毒作用,提高近期疗效。②实验研究表明,益气健脾化积方能抑制人胃癌BGC-823细胞增殖,促进细胞凋亡;并能下调NF-κB的表达。益气健脾化积方配合化疗药后,促进了对宿主NF-κB信号通路的调节作用,使胃癌细胞凋亡增加。我们认为,这可能是YJHF发挥的疗效作用及增效减毒作用的分子机制之一。本研究为解释益气健脾化积方临床治疗GC的疗效作用提供了一定的科学依据。