论文部分内容阅读
根据已知马铃薯抗青枯菌蛋白AP1编码基因ap1序列，合成了一对特异性引物P1/P2，分别引入限制性酶切位点AccI及XhoI。以P1/P2为引物，以ap1基因原核表达载体pAP217为模版，经PCR扩增得到1.2kb的ap1基因片段。选取质粒pGΩ4A为过渡载体，以AccI和XhoI双酶切ap1基因片段，与经同样双酶切的pGΩ4A线性分子相连接，经转化、筛选，成功构建了有ap1基因的植物表达盒‘2E-35S-Ω-ap1’的中间载体pAP4A。以EcoRI及HindIII双酶切pAP4A，得到这一表达盒片段，然后与经同样双酶切的植物表达载体pBI121相连接，经转化、鉴定，获得了ap1基因的植物高效表达载体pHap1。 以电激法将pHap1导入根癌农杆菌LBA4404，用叶盘法分别转化马铃薯青枯病感病品种米拉（Mira）、中-5-1、金冠以及烟草感病品种NC89的无菌试管苗。经愈伤诱导及卡那霉素（kan）筛选，分别获得了16株米拉、8株中-5-1、5株金冠以及40株NC89的kan抗性再生苗。经PCR、Southern和Northern-bloting等分子检测，表明apl基因已成功整合到转基因植株染色体上并正确转录。 分别选取米拉的两个转基因株系Ts-M-2和Ts-M-5，以及烟草的8株转基因植株，进行温室青枯病抗病性鉴定。结果表明，转基因植株的抗病性比非转基因植株对照明显提高，表现为发病或出现萎蔫症状的时间延迟和病情指数降低。 根据ap1基因序列在网上的同源性分析，发现其在同源性排列中分值最高的是酸性磷酸酶蛋白家族。对ap1基因的大肠杆菌表达产物融合蛋白及其转基因植株的粗蛋白，进行酸性磷酸酶活性测定，结果表明，ap1基因的表达产物与对照相比具有明显增加的酸性磷酸酶活性。