帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中老年人常见的神经退行性疾病,在临床上以静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓和步态异常为特征。主要病理基础是中脑黑质致密部(SNpc)多巴胺能神经元选择性进行性退变,继而引起纹状体多巴胺(DA)严重缺乏。由于PD的病因不清,至今尚无完善的治疗方案,不论药物治疗和手术治疗都只能缓解症状,而不能阻止受损伤的DA能神经元的继续退变、死亡,且均有不同程度的不良反应。因此探寻无创、避免不良反应的新疗法是当前神经科学研究的热点。PD的确切病因机制尚未探明,近年来发现神经营养因子(NTFs)与PD的发病密切相关,认为各种NTFs的缺乏可能是黑质神经元退变的原因。而在对中脑黑质DA能神经元(NDN)有作用的NTFs当中,以胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的效应更强。而在PD病人的黑质区这两种NTFs的表达减少。因此,能够上调黑质BDNF、GDNF表达的方法可能是治疗PD的有效策略。重复经颅磁刺激(rTMS)为刺激大脑皮质神经元的一种新的、非侵入性、无痛的治疗手段,当给予一组或一个序列的脉冲时,能够调节局部或远隔神经元的活动。近年来已做为神经心理疾病如PD、运动失调和抑郁等疾病的有潜力的治疗性工具。研究显示高频(>1 Hz)或低频(<1 Hz)rTMS均可改善PD的运动功能,临床应用低频刺激较高频刺激更安全,然而这种治疗性作用的机制尚不清楚。研究表明rTMS治疗PD的原理可能与其调节大脑皮质兴奋性有关,即高频增加皮质的兴奋性,而低频抑制皮质的兴奋性,另外可能还与增加纹状体内DA的释放有关。最近Funamizu等研究表明高频rTMS对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤具有神经保护作用,但未阐明具体的作用机制。Müller等报道长期高频rTMS可以增加大鼠特定脑区的BDNF表达而发挥神经保护作用。那么,低频rTMS是否通过促进PD小鼠中脑GDNF和BDNF的表达而发挥其对黑质多巴胺能神经元的保护效应?本课题拟应用MPTP诱导的PD小鼠模型,分别应用行为学检测、电生理技术、高效液相色谱-电化学检测法(HPLC-ECD)、免疫组织化学和免疫印迹分析技术,观察低频rTMS对MPTP致PD模型小鼠运动功能、皮质兴奋性、神经生化和神经病理学方面的影响,观察低频rTMS是否对MPTP诱导的PD小鼠具有治疗作用,并探讨低频rTMS对MPTP致PD模型小鼠NDN的神经保护作用及其可能的作用机制。第一部分:低频rTMS对PD模型小鼠行为学的影响目的:通过行为学检测,观察不同时间点低频rTMS对PD小鼠模型运动功能的影响。方法:56只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:盐水对照组(NS),PD模型组(PD),假磁刺激组(s-rTMS),磁刺激组(rTMS),每组14只。小鼠皮下注射MPTP(15 mg/kg/2 h,注射4次)复制急性PD模型,末次注射24 h后对rTMS组小鼠进行rTMS干预(刺激强度为1特斯拉(T),频率1 Hz,刺激5个序列,每个序列刺激25次,每个序列之间间隔2 min,每天刺激一次,连续14 d);s-rTMS组置于相同环境,但不接受磁刺激;NS组和PD组不予以任何处理。(1)观察小鼠的一般行为学表现。(2)利用rotarod实验方法记录小鼠在注射前(MPTP或NS)及末次注射(MPTP或NS)后1 d(24 h)、3、7、14 d于滚轴上停留的转数,观察低频rTMS对小鼠身体协调能力的影响。(3)利用小鼠自由活动仪记录其在注射前(MPTP或NS)及末次注射(MPTP或NS)后1 d(24 h)、3、7、14 d记录自由活动次数,观察低频rTMS对小鼠自由活动能力的影响。结果:1一般行为学观察:小鼠在每次注射MPTP后很快出现震颤、竖尾、竖毛、后肢张开、步态不稳,随着给药次数的增加,其运动减少、肢体僵硬、步态不稳、反应迟缓的表现越来越明显。每次给药后上述急性中毒症状持续5～6小时,在24小时后基本恢复。Rotarod实验结果显示:(1)各实验组内在不同时间点的比较:①NS组:在NS注射前及末次注射后1、3、7、14 d,小鼠在转杆上的旋转次数各时间点间比较差异均无统计学意义(p>0.05)。②PD及s-rTMS组:分别与在MPTP注射前相比,在MPTP末次注射后1 d,小鼠在转杆上的旋转次数均明显下降(91.54±4.95 vs 43.14±5.55, 90.26±4.39 vs 41.39±4.39, p<0.01);随着时间的延长,小鼠在转杆上的旋转次数有一轻度增加趋势,在MPTP末次注射后3、7、14 d,分别为(60.86±4.36)、(62.49±3.97) , (68.57±5.4)、(66.09±4.549)和(73.14±4.74)、(70.73±5.2),在前3 d增加稍快,之后变得较平缓。③rTMS组:在MPTP末次注射后1 d(rTMS第1 d),小鼠在转杆上的旋转次数较rTMS前明显下降(91.11±4.34 vs 41.18±6.0, p<0.01);与rTMS第1 d相比,在MPTP末次注射后3、7、14 d(rTMS第3、7、14 d),小鼠在转杆上的旋转次数有一明显增加趋势(64.57±5.5, 80.49±4.56, 85.89±3.74, p<0.01)。(2)组间比较:PD组、s-rTMS组及rTMS组小鼠停留于滚轴上的旋转次数显著低于NS组(p<0.001);rTMS组小鼠停留于滚轴上的旋转次数显著高于s-rTMS组(p<0.001),s-rTMS组与PD组比较差异无统计学意义(p>0.05)。2小鼠自主活动结果显示:(1)各实验组内在不同时间点的比较:①NS组:NS注射前及末次注射后1、3、7、14 d,自主活动记数各时间点间比较差异均无统计学意义(p>0.05)。②PD、s-rTMS和rTMS组:MPTP末次注射后1 d,小鼠自主活动记数较MPTP注射前均明显下降(133.59±6.16 vs 78.12±8.04, 129.61±6.88 vs 77.07±7.13和132.16±7.12 vs 80.49±6.59, p<0.01),但在MPTP末次注射后3、7、14 d,自主活动基本恢复到MPTP注射前状态,差异均无统计学意义(p>0.05)。(2)组间比较:PD组、s-rTMS组及rTMS组小鼠自由活动次数显著低于NS组(p<0.001)。rTMS与PD、s-rTMS组自由活动次数比较差异无统计学意义(p>0.05)。小结:该研究中应用的MPTP注射方案,能够成功建立急性PD小鼠模型,MPTP可诱导PD小鼠出现与PD患者相似的行为缺陷,主要表现为运动协调能力的下降;低频rTMS可改善PD小鼠的运动协调性,进一步证实了rTMS可以改善PD患者的运功功能的理论。第二部分:低频rTMS对PD模型小鼠大脑皮质兴奋性的影响目的:通过静息运动阈值(RMT)的检测,观察低频rTMS对PD小鼠模型大脑皮质兴奋性的影响方法:32只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:盐水对照组(NS),PD模型组(PD),假磁刺激组(s-rTMS),磁刺激组(rTMS),每组8只。小鼠皮下注射MPTP(15 mg/kg/2 h,注射4次)复制急性PD模型,末次注射24 h后对rTMS组小鼠进行rTMS干预(刺激频率为1Hz,刺激强度1 T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,连续14 d),s-rTMS组置于相同环境,但不接受磁刺激,NS组和PD组不予以任何处理。静息运动阈值(RMT)的检测:分别于注射前(MPTP或NS)及末次注射(MPTP或NS)后1 d(24 h)、3、7、14 d进行RMT的检测。结果:1各实验组内不同时间点间的比较:①NS组:在NS注射前及末次注射后1、3、7、14 d,RMT各时间点间比较均无差异统计学意义(p>0.05)。②PD、s-rTMS组:分别与MPTP注射前相比,在MPTP末次注射后1 d,小鼠的RMT均明显下降(25.13±2.03 vs 22.38±1.41, 25±2 vs 21.88±1.36, p<0.05);在MPTP末次注射后3、7、14 d,两组小鼠的RMT继续有一轻度下降趋势(21.88±1.73)、(21.25±1.49),(21.38±1.92)、(21±2.27)和(21.25±1.39)、(20.88±1.81),但变化较平缓。③rTMS组:与MPTP注射前相比,在MPTP末次注射后1 d(rTMS第1 d),小鼠的RMT明显下降((24.88±2.03 vs 21.75±1.98)(p<0.05);与rTMS第1 d相比,在MPTP末次注射后3 d(rTMS第3 d),小鼠的RMT有一定的的增加(22.88±2.23),但差异无统计学意义(p>0.05),在rTMS第7、14 d,小鼠的RMT明显增加(23.5±1.51 )、(23.88±1.64)(p<0.05)。2组间比较:PD组、s-rTMS组及rTMS组RMT值显著低于NS组(p<0.001)。但rTMS组RMT值与PD组及s-rTMS组比较显著增高(p<0.01),PD与s-rTMS组比较差异无统计学意义(p>0.05)。小结:MPTP致PD小鼠的RMT降低,运动皮质兴奋性增加;低频rTMS能够抑制PD小鼠增加的运动皮质兴奋性,提示运动皮质可能是rTMS治疗PD的有效靶点,由此为临床上应用低频rTMS治疗PD病人提供了电生理学方面的依据。第三部分:低频rTMS对帕金森病小鼠纹状体DA及其代谢产物的影响目的:应用HPLC-ECD法观察低频rTMS对PD小鼠的纹状体内DA及其代谢产物高香草酸(HVA)、二羟苯乙酸(DOPAC)含量的影响。方法:24只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:盐水对照组(NS),PD模型组(PD),假磁刺激组(s-rTMS),磁刺激组(rTMS),每组6只。小鼠皮下注射MPTP(15 mg/kg/2 h,注射4次)复制急性PD模型,末次注射24 h后对rTMS组小鼠进行rTMS干预(刺激频率为1 Hz,刺激强度1 T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,连续14 d),s-rTMS组置于相同环境,但不接受磁刺激;NS组和PD组不予以任何处理。最后一次刺激24 h后,在行为学检测后,小鼠被断颈处死取新鲜脑纹状体组织。应用HPLC-ECD法测定纹状体内DA、HVA及DOPAC的含量。结果:与NS组比较,PD组小鼠纹状体DA含量显著降低(151.26±38.46 vs 515.44±90.02),差异具有统计学意义(p<0.01),DA下降幅度为70.65%,DA代谢产物HVA及DOPAC含量也显著降低(809.91±121.88 vs 593.34±36.45, 1180.11±641.25 vs 409.03±275.6),差异具有统计学意义(p<0.01)。与s-rTMS组比较,rTMS组小鼠纹状体DA、HVA及DOPAC含量明显增加(185.98±40.7 vs 258.21±50.35, 622.69±50.95 vs 711.89±54.02, 386.84±192.95 vs 936.8±373.61),差异具有统计学意义(p<0.05)。以上DA、HVA及DOPAC含量各指标在PD组与s-rTMS组之间差异无统计学意义(p >0.05)。小结:该研究中采用的MPTP注射方案导致PD小鼠纹状体内DA及其代谢产物显著降低,表现为与临床PD患者相似的生化特征;低频rTMS可能通过增加PD小鼠纹状体DA及其代谢产物含量而发挥其治疗作用。第四部分:低频rTMS对帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用及其机制目的:探讨低频rTMS对MPTP诱导的PD小鼠模型NDN的保护作用及其可能的作用机制。方法:56只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:盐水对照组(NS), PD模型组(PD),假磁刺激组(s-rTMS),磁刺激组(rTMS),每组14只。小鼠皮下注射MPTP(15 mg/kg/2 h,注射4次)复制急性PD模型,末次注射24 h后对rTMS组小鼠进行rTMS干预(刺激频率为1Hz,刺激强度1T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,共14 d)。最后一次刺激24 h后,在行为学检测后,每组取8只进行脑灌注固定,然后取中脑行连续冠状冰冻切片,进行黑质区酪氨酸羟化酶免疫反应阳性(TH-ir)、脑源性神经营养因子免疫反应阳性(BDNF-ir)及胶质源性神经营养因子免疫反应阳性(GDNF-ir)细胞的免疫组织化学分析;另外每组取6只用于断头取脑SN活组织,进行黑质区TH、BDNF及GDNF蛋白的Western blot分析,并借助图像分析系统对所有指标进行定量。结果:1免疫组织化学染色结果:(1)TH免疫组织化学染色结果显示:NS组SNc区TH-ir细胞密集,着色深,突起较长;与NS组比较,PD组SNc区TH-ir细胞数量明显减少(71.88±4.26 vs 31.67±3.35),差异具有统计学意义(p<0.01),减少比例为55.94%,胞浆着色浅,分布较稀疏,有些细胞可见皱缩,突起较短,PD组相应的COD值亦明显降低(0.3321±0.036 vs 0.2196±0.0182),差异具有统计学意义(p<0.01)。与s-rTMS组比较,rTMS组SNc区TH-ir细胞计数、COD值均明显增加(32.45±3.31 vs 36.67±3.82, 0.2259±0.0292 vs 0.2795±0.0258),差异具有统计学意义(p<0.05),胞浆着色较深,分布较密集。以上各指标在s-rTMS组与PD组之间差异无统计学意义(p>0.05)。(2)BDNF免疫组织化学染色结果显示:NS组SNc区BDNF-ir细胞密集,着色深;与NS组比较,PD组SNc区BDNF-ir细胞数及COD值均明显减少(92.85±7.61 vs 62.99±5.97, 0.3180±0.0224 vs 0.2793±0.0220),差异无统计学意义(p<0.01),胞浆着色浅,分布较稀疏;与s-rTMS组比较,rTMS组SNc区BDNF-ir细胞计数、COD值均明显增加(61.63±6.61 vs 70.20±6.12, 0.2842±0.0195 vs 0.3069±0.0203),差异具有统计学意义(p<0.05),着色较深,分布较密集;以上各指标在s-rTMS组与PD组之间差异无统计学意义(p>0.05)。(3) GDNF免疫组织化学染色结果:NS组黑质区GDNF-ir细胞密集,着色深;与NS组比较,PD组黑质区阳性细胞数及COD值均明显减少(100.11±9.66 vs 73.22±7.77, 0.3381±0.0304 vs 0.4169±0.0270),差异具有统计学意义(p<0.01),胞浆着色浅,分布较稀疏;与s-rTMS组比较,rTMS组黑质区GDNF-ir细胞计数、COD值明显增加(74.48±7.84 vs 84.2±9.65, 0.3414±0.0360 vs 0.3761±0.0267),差异具有统计学意义(p<0.05),染色较深,分布较密集;以上各指标在s-rTMS组与PD组之间差异无统计学意义(p>0.05)。(4)相关性分析:各组小鼠黑质区SN区TH-ir与BDNF-ir细胞计数及其相应的COD值呈明显正相关(p<0.05)。各组SN区TH-ir与GDNF-ir细胞计数及相应的COD值也呈明显正相关(p<0.05)。2 Western blot结果:(1)TH蛋白Western blot分析结果显示:与NS组比较,PD组的TH条带明显淡化,ROD值明显下降(0.8443±0.0797 vs 0.6893±0.0675),差异具有统计学意义(p<0.01);与s-rTMS组比较,rTMS组TH条带明显加深,ROD值明显增加(0.6978±0.0988 vs 0.8074±0.0702),差异具有统计学意义(p<0.05),在s-rTMS组与PD组之间TH条带ROD值差异无统计学意义(p>0.05)。(2)BDNF蛋白Western blot分析结果显示:BDNF蛋白,表现为相对分子质量为18kD(单体, BDNF-monomer)和相对分子质量为30kD的两条条带(同源二聚体, BDNF-homodimer)。与NS组比较,PD组的BDNF-monomer及BDNF-homodimer条带明显变淡,ROD值均明显下降(0.988±0.0656 vs 0.815±0.0373,0.972±0.0907 vs 0.772±0.0621),差异具有统计学意义(p<0.01);与s-rTMS组比较,rTMS组BDNF-monomer及BDNF-homodimer条带明显加深,ROD值均明显增加(0.792±0.0598 vs 0.905±0.0983, 0.792±0.07 vs 0.893±0.0952),差异具有统计学意义(p<0.05);在s-rTMS组与PD组之间BDNF-monomer及BDNF-homodimer蛋白表达则差异均无统计学意义(p>0.05)。(3)GDNF蛋白Western blot结果显示:与NS组比较,PD组的GDNF蛋白条带明显淡化,ROD值明显下降(0.872±0.0652 vs 0.697±0.0914),差异具有统计学意义(p<0.01);与s-rTMS组比较,rTMS组GDNF蛋白条带明显加深,ROD值明显增高(0.684±0.0130 vs 0.843±0.0879),差异具有统计学意义(p<0.05);在s-rTMS组与PD组之间GDNF蛋白条带ROD值差异无统计学意义(p>0.05)。(4)相关性分析显示:各组小鼠黑质区TH与BDNF-monomer或BDNF-homodimer蛋白表达呈明显正相关(p<0.05),TH与GDNF蛋白表达也呈明显正相关(p<0.05)。小结:1该研究中应用的MPTP注射方案确能选择性损伤NDN,符合PD的典型病理特征;2低频rTMS能够防止MPTP诱导的NDN的退变,明显增加PD小鼠黑质区TH的表达水平,其机制可能是与上调黑质区BDNF和GDNF蛋白的表达水平有关。结论C57BL/6J小鼠皮下注射MPTP每次15 mg/kg,连续注射4次,每次间隔2小时,能够成功建立急性PD小鼠模型。本研究中应用的rTMS设计方案(刺激频率为1Hz,刺激强度1T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,共14 d)可能通过抑制增加的皮质兴奋性、减缓或防止NDN的变性、缺失和促进纹状体DA的合成或释放对PD小鼠产生有益的效应。研究表明低频rTMS对黑质多巴胺能神经元具有保护作用,而这可能部分与rTMS诱导黑质区BDNF和GDNF蛋白表达水平增加有关。本实验能够为低频rTMS在PD患者的临床治疗和康复提供一定的理论依据,rTMS可以做为PD患者治疗或辅助治疗的一种有价值的手段。