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α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20),又名α-D-葡萄糖苷水解酶,可以催化水解低聚糖类生成葡萄糖,其在自然界中广泛分布,性质各异。来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的α-葡萄糖苷酶不仅具有水解活性,还具有转苷能力。当A.nigerα-葡萄糖苷酶作用于麦芽糖时,能够切割开麦芽糖的α-1,4糖苷键,将游离出来的葡萄糖残基以α-1,6形式转移到其他糖底物上,形成具有非发酵性的功能性低聚糖--低聚异麦芽糖(简称IMOs,主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等),因此在工业上广泛应用于IMOs的生产。
本实验室前期的研究工作中,通过重叠PCR扩增得到A.nige SG136的α-葡萄糖苷酶cDNA,并在毕赤酵母(Picha pastoris)中表达,但是所获得的重组酶生化活性较低。本研究以A.niger CICIM F0620的总RNA为模板,通过RT-PCR获得α-葡萄糖苷酶cDNA,并在P.pastoris KM71中表达,同时对重组P.pastoris生产α-葡萄糖苷酶的发酵工艺和重组酶的酶学性质进行研究。主要研究结果如下:
(1)以A,niger CICIM F0620的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到全长为2883bp的α-葡萄糖苷酶cDNA。将该cDNA克隆到P.pastoris表达载体pPIC9K上,BglⅡ酶切线性化后电转入P.pastoris菌株KM71,经过MD、YPD/G418平板筛选,获得重组菌株:KM71/pPIC9K-aglu。摇瓶发酵条件下诱导120h,重组菌发酵上清液中的pNPG水解酶活为0.44U/mL。
(2)考察基因工程KM71/pPIC9K-aglu的摇瓶发酵情况,确定适宜的发酵条件为:诱导阶段初始菌浓OD600为50,诱导pH5,诱导温度28℃,每24h添加1.5％(v/v)甲醇,诱导表达周期120h,酶活可达到1.15U/mL,是原始野生菌产酶量的18.2倍。
(3)在3L发酵罐上,通过优化诱导起始菌浓和起始甲醇添加量,KM71/pPIC9K-aglu诱导96h后发酵上清液的pNPG水解酶活达3.51U/mL,蛋白含量为1759μg/mL。其酶活和蛋白含量分别是摇瓶水平的3.0和3.4倍。在30 L罐上进行进一步试验,终酶活达到5.12U/mL,表达量为现有报道中的最高水平。
(4)将重组酵母的发酵上清液经过3 kDa超滤膜浓缩、乙醇沉淀、疏水柱层析后得到纯化的重组α-葡萄糖苷酶。重组α-葡萄糖苷酶在溶液中以二聚体形式存在。SDS-PACE电泳表明,重组酶的分子量为145kDa,经去糖基化酶Endo Hf处理后,分子量减少至115kDa,证明重组酶在P.pastoris表达系统中受到糖基化修饰。重组α-葡萄糖苷酶的最适温度为60℃,在50℃具有良好的热稳定性;最适pH为4.5,pH稳定范围为pH3.0～7.0。在50℃,pH4.5,以pNPG为底物,Km和Vmax分别为0.45mM和43.48U/mg。大多数金属对重组α-葡萄糖苷酶的酶活性无明显影响。
(5)重组α-葡萄糖苷酶具有转苷活性,可转化麦芽糖生成IMOs,转苷能力与市售α-葡萄糖苷酶相近。重组酶的最优转苷条件为:pH5.0的30％(w/v)麦芽糖溶液,加酶量0.05U/g麦芽糖,60℃反应20～24h。在最优反应条件下,IMOs的产量可达183.12g/L,转化率为60％。本研究为重组α-葡萄糖苷酶的工业化大规模生产和在功能性低聚糖生产行业中的应用奠定了基础。