组织或器官再生的目标是完全恢复缺失组织或器官的结构和功能。牙科学研究者们热切欢迎三维细胞打印构建组织工程牙齿的技术,因为它可能代表一种理想的组织器官替代医学的方法。人的牙齿替换只有一次,牙釉质本身不能再生。因此,当牙齿或釉质缺失,需人工重建。研究成牙组织工程和干细胞生物学的目的是明确更换丢失或损坏的牙齿的策略方法。由干细胞衍生的特定组织,如牙本质和骨,已临床应用,但完整牙齿的组织工程方法仍在研究中。三维数字化组织工程再造复合型、多胚层来源的功能性组织和器官的一个基本要求,就是首先要充分明确该组织器官的组成成分以及他们之间的组织结构。医学影像技术是组织工程必不可少的工具,可以在细胞、组织、器官直至生物体水平提供三维结构以及功能学信息。这些技术包括计算机断层扫描和磁共振成像,计算机辅助设计和计算机辅助制造工具和数学建模也用来收集组织的复杂断层结构信息并加以数字化。完成的组织或器官模型将导入数字化模拟控制的生物打印设计和制造系统。系统软件完成将三维重建模型逆向切片到二维的实现过程,使得3D模型分为薄层二维水平切片,然后导入到生物打印系统。包含在二维水平切片的解剖和结构信息提供生物打印机分层打印不同细胞及胞外基质的指令数据。我们基于构建三维细胞喷墨生物打印机的系统要求,在本研究采用了多种方法构建三维数字化牙胚作为三维细胞喷墨打印的模板。牙胚发育过程参与细胞明确,结构相对简单,本研究选择牙胚作为三维生物打印技术研究的模式器官具有创新性与先进性。第一部分犬发育早期牙胚三维数字化模型的构建与分析,包括三个实验。实验一,不同发育时期犬恒牙胚的Micro CT三维数字化模型的构建。选择新生犬,4周龄与5月龄犬作为不同发育阶段的代表,使用Micro CT和CBCT研究牙胚发育状态。结果表明新生犬乳牙牙冠矿化,恒牙胚尚未见明显发育。5月龄犬处于乳恒牙替换开始期,恒牙胚牙冠已矿化,大部分牙齿处于替换期。4周龄犬处于乳牙开始萌出期,第四恒前磨牙及第一恒磨牙牙胚体积大,分别为967.4 mm3与46.6 mm3,处于未矿化钟状期,适于作为后续细胞打印构建发育期牙胚的三维数字化模板。本研究首次以20μm的超精细分辨率构建了4周龄犬发育期牙胚的Micro CT三维数字化模型,该模型的分辨率达到了细胞水平,单个像素基本可以对应1个细胞,基本可以满足单细胞喷墨打印的需求。另外该三维牙胚模板可以进行多种三维数字化文件格式的转化与识别,可以任意角度与层厚进行再切片运算,可以生成不同层厚与分辨率的二维打印模板数据,从而满足部分三维生物打印系统的需要。构建的三维数字化模板以Micro CT数据构建,无法实现牙胚多种细胞的精细空间定位与细胞密度分配,另外对于细胞外基质与细胞的比例也无法进行分析,对于毛细血管网结构也无法分辨构建,这就要求进一步使用组织学方法来构建超精度的牙胚三维数字化模板以满足多细胞打印的准确定位与细胞密度及胞外基质比例控制。实验二,犬钟状期恒牙胚细胞学三维数字化模型的构建。我们选择实验一的4周龄幼犬的第四恒前磨牙牙胚作为三维组织学重建的研究对象,采用HE染色连续牙胚切片,共切取切片730张,其中获得684张有效切片,有效切片率93.7%。使用Pannoramic SCAN数字化切片扫描系统依次进行扫描,获得分辨率为0.52μm/像素的扫描数据,以实验一完成的Micro CT三维重建数据进行组织切片的对正校准,对正后的切片数据导入Pannoramic Viewer软件,对牙胚切片数据进行三维重建,构建了发育早期牙胚的微米级三维立体细胞学数字化模型,软件可以将上述模型转化为多种格式,适于不同需要。实验三,犬恒牙胚中多种细胞、胞外基质及微血管的空间分布与定位研究。使用Pannoramic Viewer和Pannoramic Histo Quant软件进行计算机图形分析,对牙胚细胞学三维数字化模型进行多种细胞、胞外基质及微血管的空间分布与定位研究,为合理构建细胞墨水的成分,构建三维打印软件可识别的打印模板提供解决方案。结果表明牙乳头区域细胞空间分布密度为约44.74×106/ml,牙囊区域细胞密度为16.20×106/ml,星网状层细胞密度为8.30×106/ml。外釉上皮层细胞5-8层,宽度50-60μm,细胞密度3-4×108/ml。内釉上皮层细胞4-6层,宽度40-50μm,细胞密度8-10×108/ml。成牙本质细胞层细胞3-5层,宽度30-40μm,细胞密度8-10×108/ml。上皮根鞘细胞密度达3-5×108/ml。每毫升牙囊结构中的细胞体积比例为0.021ml,牙乳头结构中的细胞体积比例为0.137ml,星网状层结构中的细胞体积比例为0.007ml,其余为胞外基质的体积。牙胚的牙囊与牙乳头结构中存在血管网络,而在成釉器星网状层结构中未见血管网存在,牙乳头中的血管结构分布密度为26.3±4.6个/mm2,牙囊中的血管结构分布不均匀,微血管及毛细血管交叉存在。使用Imaris软件可以三维重建局部血管网,立体直观显示血管结构,可以提供后续血管网打印的模板。该模型中获得的各型细胞的分布特点与密度为进一步构建含细胞生物墨水提供理论依据。第二部分,含细胞海藻酸钠水凝胶3D打印生物墨水的研制与性能测试,包括三个实验。利用体外培养牙胚发育相关细胞,构建了基于海藻酸钠水凝胶的生物墨水,利用墨滴观测仪等设备研究了生物墨水稳定打印的理化条件,获得了稳定打印的细胞生物墨水配方。体外诱导牙乳头细胞分化,研究了打印对于细胞分化,活力,增殖等生物学性能的影响,明确本研究构建的生物墨水对于稳定打印细胞并维持细胞生物学特性无显著影响,为进一步三维多种细胞打印构建组织工程牙胚提供了必要的技术支持。实验一,牙乳头细胞的分离培养与鉴定。基于第一部分获得的犬早期发育牙胚,在体外培养牙乳头细胞并对其生物学性状进行了研究。通过流式细胞仪检测细胞表面抗原的分析,造血干细胞标记表达阴性,间充质细胞标志物表达阳性。体外培养牙乳头细胞成骨诱导后ALP活性高于对照组细胞,骨钙素含量约为对照组细胞20倍。成骨诱导组细胞出现明显的矿化钙结节,钙黄绿素定量荧光分析结果显示成骨诱导组的荧光强度明显高于对照组。研究表明牙乳头细胞为具有成骨分化的间充质细胞。实验二,3D打印生物墨水的研发及其打印稳定性研究。基于海藻酸钠制备生物墨水,使用ARG2流变仪与FM40 Easy Drop接触角测量仪,测量液体粘度与表面张力。以1.0%海藻酸钠DMEM培养液制备生物墨水,添加0.05%枸橼酸钠拮抗DMEM培养液中的钙离子,0.1%泊洛沙姆188与含氟表面活性剂0.01%Capstone®FS-3100或0.05%Novec®FC-4430联合降低表面张力,制备了满足压电式喷头打印所需粘度与表面张力特性的生物墨水,墨水粘度特性满足细胞稳定悬浮需要。使用XAAR128压电阵列式打印喷头与墨滴观测仪进行含细胞生物墨水打印测试,通过优化生物墨水中的细胞浓度为1.2×107细胞/ml,可以实现平均每个打印墨滴中含有单个细胞的稳定打印。实验三,喷射打印对细胞活力、增殖、分化与细胞特性的影响。将牙乳头细胞以6×106细胞/ml的浓度悬浮于含表面活性剂的生物墨水中,将5×104个细胞喷墨打印至12孔板,加入1ml DMEM培养液培养,作为细胞打印组;将同等浓度细胞悬浮于无表面活性剂的生物墨水中,取5×104个细胞加入1ml培养液中作为无表面活性剂组;将5×104个牙乳头细胞直接加入1ml培养液中作为对照组。结果表明牙乳头细胞悬浮于无表面活性剂生物墨水的生存活力稍高于单独暴露于DMEM培养液的对照组细胞,喷墨打印的牙乳头细胞相对于对照组,仍然保持>95%的细胞存活,并且证明在48小时后的增殖速度与对照组无明显差异。打印后牙乳头细胞成骨诱导分化的骨钙素表达与对照组无明显差别,结果表明,喷墨打印对牙乳头细胞成骨分化能力无明显影响。本研究进一步证明,研究构建的藻酸盐生物墨水具有稳定的打印特性,可以从XAAR128阵列式打印喷头稳定喷射,同时保持打印的细胞密度和细胞活力及增殖分化能力。本研究使标准的商业化打印喷头完美打印细胞构建组织工程器官成为可能,允许多种细胞高通量快速构建组织。以后的进一步研究中,我们需要进行的重点工作是研发可同时喷墨打印多种细胞与材料的三维生物打印机,这是制造多层细胞结构和更大组织器官的基本需求。我们将使用多组XAAR128阵列式打印喷头,构建可以同时打印多种材料与细胞的三维生物打印机,利用本研究构建的三维牙胚数字化模型作为打印模板,分层打印多种牙胚细胞与胞外基质以构建可发育牙胚,并深入研究促进牙胚的体外发育矿化。