目的:本研究将难溶性药物黄体酮制备成黄体酮纳米晶注射液,以提高黄体酮的饱和溶解度、释放速率和药效,提高黄体酮的相对生物利用度同时减小刺激性,降低毒副作用。本课题制备了黄体酮纳米晶注射液并表征其形貌、粒径和晶型稳定性,进行体外纳米效应评价、安全性评价和药代动力学研究,并与市售制剂黄体酮注射液进行对比,拟在评价黄体酮纳米晶注射液用于预防早产,孕妇保胎的优势及可行性。内容:进行黄体酮纳米晶体的处方工艺研究,筛选合适的研磨仪器、转速及时间,以黄体酮纳米晶体的粒径、电位、多分散系数等作为主要的评价指标,确定该注射液的最优处方组成、最佳工艺条件;通过透射电镜、激光粒度仪、差示扫描量热法、X射线粉末衍射法和傅氏转换红外线光谱法分析,确定黄体酮纳米晶体的形貌、粒径,电位、结构和晶型稳定性等微观特征;建立了黄体酮高效液相色谱的含量测定方法,评价黄体酮纳米晶注射液在提高药物的饱和溶解度和释放速度等方面的纳米效应;通过在大鼠体内肌肉注射黄体酮纳米晶注射液和市售黄体酮注射液,分别对这两种制剂进行了药代动力学研究,评价它们的药代动力学特征;通过溶血试验和家兔肌肉局部刺激性实验评价了黄体酮纳米晶注射液的安全性。方法:采用介质研磨法制备黄体酮纳米晶注射液,以粒径、多分散系数、Zeta电位和放置稳定性为指标,通过单一稳定剂和复合稳定剂种类及用量的筛选,优化关键工艺参数,确定了黄体酮纳米晶注射液的最优处方和研磨工艺。通过透射电镜测量了黄体酮纳米晶体的形貌和大小,将黄体酮纳米晶注射液冻干成粉末,通过X射线粉末衍射对其晶型结构进行了分析,通过差示扫描量热法对其相变温度进行了考察,傅氏转换红外线光谱法对其化学结构进行了分析,并与黄体酮原料药进行相应的对比,考察分析黄体酮经过湿磨机研磨后,晶型的稳定性。建立黄体酮HPLC含量测定分析方法,通过透析袋和摇床法对黄体酮纳米晶注射液和黄体酮原料药的体外释放速率和饱和溶解度进行了对比研究。建立了大鼠血浆中黄体酮的HPLC-MS分析方法,并考察了黄体酮纳米晶注射液和市售黄体酮注射液在肌肉注射给药后大鼠体内的药代动力学特征。安全性评价部分中对黄体酮纳米晶注射液进行了溶血实验,定性且定量地分析了该注射液溶血性的大小。家兔肌肉刺激性实验中,通过与市售黄体酮注射液的对比研究,判断其刺激性的大小。结果:通过对黄体酮进行单一稳定剂和复合稳定剂的种类及用量筛选,确定了吐温80为其单一保护剂,通过制备方法的比较,确定了湿磨机为优选仪器,并通过调节转速和研磨时间等工艺参数,进一步的优化制备工艺。检测时根据仪器要求和药物本身的特点,确定了最佳检测稀释倍数为1000倍。黄体酮纳米晶注射液为乳白色混悬液体,将其稀释至100μg/m L时,经透射电子显微镜对黄体酮纳米晶进行形貌分析,由结果可知,黄体酮纳米晶体呈规则的长方形,边缘较整齐,形态均一并且分布均匀,粒径大小约300nm左右。经X射线粉末衍射分析,黄体酮纳米晶体和原料药均由很多定形结构的晶型和少量无定形结构组成,在相同衍射角处有形状大小均相似的特征衍射峰,它们的晶型结构基本一致。在差示扫描量热法分析中,黄体酮纳米晶体和原料药在相近温度下出峰,相变温度没有大的改变。在傅氏转换红外线光谱法分析中,两药物均在相同波数下出峰,未出现新的吸收峰且吸收峰未发生位移或消失,说明官能团、结构未发生改变,制剂中无新的化学键产生。其化学结构未发生改变,晶型结构稳定。建立了黄体酮的HPLC含量测定方法,黄体酮在2.034-152.52μg/mL(y=60.231x-53.088,r>0.999)浓度范围内线性关系良好。并将黄体酮纳米晶注射液与原料药做对比,摇床法测定其饱和溶解度,发现该注射液在水中的饱和溶解度约为原料药的8倍,其饱和溶解度显著提高。在透析法实验中,发现黄体酮纳米晶注射液在PBS溶液中释放迅速,2h便可释放90%,而黄体酮原料药与辅料的物理混合物释放则较为缓慢,接近40h时,释放量才达到85%,黄体酮在制备为纳米晶注射液后,释放速率也显著提高。建立黄体酮在大鼠血浆中的HPLC-MS含量测定分析方法,药物浓度在2ng/mL-5000ng/mL间有良好的线性关系,y=0.887041x+0.028667,相关系数r>0.999。为排除大鼠个体内、个体间差异及内源性激素的影响,选用雄性SD插管大鼠进行自身对照实验,分别于大腿肌肉外侧注射黄体酮纳米晶注射液和市售黄体酮注射液。结果两制剂的达峰时间分别为8.4±13.5h和40±6.9h,达峰浓度分别为673.7±889.4μg/m L和258.3±603.3μg/m L。黄体酮纳米晶注射液的达峰时间显著小于黄体酮注射液,Cmax和AUC0–t分别为黄体酮注射液的2.6和2.7倍,该注射液在大鼠体内的生物利用度高于黄体酮注射液。在黄体酮纳米晶注射液的安全性评价中,对其进行了溶血试验,发现在1h后,加入药物较多的两管溶液中出现了轻微溶血现象,直到3h,剩余各管均未出现溶血、凝集现象。参考相关文献,在1小时后,3-5号试管均未出现部分或全部溶血和凝集反应的,均可用于注射。因此判断,黄体酮纳米晶注射液的轻微溶血反应是可以被接受的。通过对其溶血性进行定量分析,发现随着药物的减少溶血率依次减小,且所有数值均小于5%,符合注射液安全性要求。在家兔肌肉刺激性实验中,通过与市售黄体酮注射液的对比,其肌肉组织中,主要以肌纤维变性、炎性细胞的渗出为主,出血较少,范围较广,属于早期炎症反应。反应刺激性级数为2,属于轻度刺激性。而市售制剂主要以肌纤维的萎缩、坏死和纤维结缔组织增生为主,出血较多,范围较广,同时伴有大量的“囊泡”,属于晚期炎症,刺激性级数为3-4,即中到重度刺激性。因此,黄体酮纳米晶注射液的肌肉刺激性比市售黄体酮注射液小。结论:通过湿磨机制备及相关工艺参数的调整,对黄体酮纳米晶注射液进行处方筛选和用量考察,初步筛选出合适的辅料及用量配比,并对其制备工艺进一步优化;通过透射电镜、激光粒度仪、差示扫描量热法、X射线粉末衍射法和傅氏转换红外线光谱法分析中可知纳米晶为300nm左右的规则长方形,分布均匀,晶型稳定;摇床法和透析袋实验中,黄体酮纳米晶注射液饱和溶解度和释放度均显著提高;其溶血率较低,刺激性较小,安全性较高,在与市售黄体酮注射液药代动力学对比研究中,生物利用度显著提高。综上所述,湿磨机制备的黄体酮纳米晶注射液处方工艺可行,晶型稳定,粒径均一,在提高释放速率、饱和溶解度和生物利用度的同时降低了肌肉刺激性,黄体酮纳米晶注射液具有一定的临床研究意义。