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植物激素脱落酸ABA(abscisic acid)广泛的存在于水生植物如藻类以及众多陆生植物当中,可以调控植物的生长与发育以及应答病菌、低温、干旱和盐碱等的多种生物胁迫反应和非生物胁迫反应。而ABI5亚家族是一类碱性亮氨酸拉链类型(Basic leucine zipper,bZIP)转录因子,参与了植物种子在胚胎发育晚期时的基因表达与调控以及ABA信号的转导。本实验室早期的研究结果表明在ABI5当中存在有两个能够激活报告基因的区域,其中一个是在于羧基端的非保守区域,而另一个则是具有保守性的保守区II(CRII保守区域)。一般可以采用酵母单杂交或者是酵母双杂交的方法来研究转录因子的转录激活活性,那么对于ABI5亚家族成员中的保守区域II是否在植物的细胞当中也存在有转录激活活性呢?而且SnRK2.6激酶是否可以激活ABI5的转录激活活性,从而和ABI5在酵母细胞里发生相互作用呢?为了回答这些问题,本研究论文对于ABI5亚家族成员在酵母细胞当中以及植物细胞当中的转录激活活性进行了深入的研究。本论文的主要研究结果如下所示:(1)利用酵母单杂交系统在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae AH109)中分析了ABI5亚家族成员保守区域Ⅱ的转录激活活性,并且进行了β-半乳糖苷酶活性的测定用以定量分析其转录激活活性,实验结果表明DPBF4CRⅡ的转录激活活性相对较高,而DPBF5 CRⅡ、ABF2 CRⅡ、DPBF2 CRⅡ、ABF1 CRⅡ、ABF4 CRⅡ、DPBF3 CRⅡ、ABI5 CRⅡ、At5G42910 CRⅡ的转录激活活性依次减弱。(2)利用酵母双杂交系统对SnRK2.6激酶与ABI5的转录激活活性进行了分析,实验结果表明pGADT7与ABI5没有发生相互作用,即ABI5自身无转录激活活性,但是SnRK2.6激酶可以和ABI5在酵母细胞里发生相互作用,即SnRK2.6可能会激活ABI5的转录激活活性,并且研究结果表明ABI5的第42位丝氨酸、第145位丝氨酸、第156位苏氨酸、第201位苏氨酸可能会与SnRK2.6激活ABI5的转录激活活性的过程有关系。(3)通过在植物原生质体的细胞中进行瞬间表达分析ABI5亚家族成员保守区Ⅱ的转录激活活性,实验结果表明实验组一:ABF1CRⅡ+pHQRep(6x)+pLUC的GUS/LUC比值为0.111,实验组二:ABF2CRⅡ+pHQRep(6x)+pLUC的GUS/LUC比值为0.055,实验组三:ABF4CRⅡ+pHQRep(6x)+pLUC的GUS/LUC比值为0.108,实验组四:ABI5CRⅡ+pHQRep(6x)+pLUC的GUS/LUC比值为0.843,实验组五:DPBF2CRⅡ+pHQRep(6x)+pLUC的GUS/LUC比值为0.376,实验组六:DPBF3CRⅡ+pHQRep(6x)+pLUC的GUS/LUC比值为0.096,实验组七:DPBF4CRⅡ+pHQRep(6x)+pLUC的GUS/LUC比值为2.557,实验组八:DPBF5CRⅡ+pHQRep(6x)+pLUC的GUS/LUC比值为1.371,实验组九:At5G42910CRⅡ+pHQRep(6x)+pLUC的GUS/LUC比值为0.353。从以上数据可以看出,报告基因GUS在植物的瞬间表达分析系统中,随着培养时间的延长,GUS酶的活性稳步增加,GUS酶在拟南芥原生质体中存在内源活性,这说明ABI5亚家族成员的保守区Ⅱ(CRⅡ)在植物细胞当中具有转录激活活性,而且在植物原生质体细胞当中,ABI5亚家族成员中的DPBF4保守区Ⅱ(CRⅡ)的转录激活活性是相对较高的,这与在酵母单杂交当中得出的结果相似。(4)为了以后在酿酒酵母AH109细胞中以及植物原生质体的细胞中继续深入研究ABI5亚家族成员保守区Ⅱ的转录激活活性,本研究构建了pGADT7-SnRK2.6载体和pYLUC载体,用于后续相关的酵母双杂交实验和瞬间表达分析实验。(5)为了研究在报告基因当中增加的GAL4的结合位点UASGal1的重复序列是否能够提高下游的报告基因的表达,本实验以内参载体pLUC为主,重新在植物原生质体细胞当中进行了DPBF4成员保守区Ⅱ(CRII)的转录激活活性的研究,得出的实验结果显示实验组一:pHQEff-6+pHQRep(3×)+pLUC的GUS/LUC比值为195.876,实验组二:pHQEff-6+pHQRep(6×)+pLUC的GUS/LUC比值为275.814,实验组三:pHQRep(3×)+pLUC的GUS/LUC比值为123.703,实验组四:pHQRep(6×)+pLUC的GUS/LUC比值为159.013,且由数据表明,实验组二pHQEff-6+pHQRep(6×)+pLUC的GUS/LUC比值是实验组一pHQEff-6+pHQRep(3×)+pLUC的GUS/LUC比值的1.41倍,实验组四pHQRep(6×)+pLUC的GUS/LUC比值是实验组三pHQRep(3×)+pLUC的GUS/LUC比值的1.29倍。而由于pHQEff-6含有DPBF4保守区Ⅱ基因编码片段,pHQRep(3×)和pHQRep(6×)含有GAL4DBD上游激活元件UASGal1的重复序列,因此可以说明DPBF4的保守区Ⅱ可以在拟南芥的原生质体细胞中激活下游基因GUS的转录,并且在报告基因当中增加的GAL4的结合位点UASGal1的重复序列能够提高下游的报告基因的表达,然而这种活性的升高趋势与UASGal1的重复数量并不是呈线性关系的。