研究背景:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是定植于胃黏膜的革兰氏阴性病原菌。目前,世界范围内超过50%的人口感染了该病原菌。自从1982年澳大利亚学者Barry Marshall和Robin Warren发现H.pylori以来,随后的大量研究证明,H.pylori感染与多种胃部疾病的发生发展相关,包括慢性胃炎、胃溃疡和胃癌（Gastric cancer,GC）。目前,抗生素仍是根除H.pylori的主要方式。但是,近年的研究显示,其耐药率在不断上升。目前阶段,H.pylori感染具有感染率高,范围广,引发多种胃部疾病和耐药率上升的特点。因此,对H.pylori感染的致病机理进行深入研究具有重要的临床意义。H.pylori胃炎是H.pylori相关胃病的基础。胃上皮细胞（Gastric epithelial cells,GECs）是H.pylori与宿主最先接触的细胞类型,两者的相互作用已经被证实在H.pylori胃炎中具有重要的作用。转录因子（Transcription factors,TFs）可显著的影响胃上皮细胞的稳态。ETS1（E26 transformation specific proto-oncogene 1,transcription factor）是ETS转录因子家族的一员,并且参与多种炎性疾病的发生和进展。研究发现,ETS1在正常GECs中不表达,却在胃癌细胞中存在表达,并且同胃癌细胞的侵袭和转移密切相关。我们前期研究发现H.pylori感染能够诱导GECs表达ETS1。目前,ETS1在H.pylori胃炎中的表达模式、调控机制和功能作用仍未知。因此,阐明H.pylori感染诱导GECs内ETS1表达的调控机制以及功能作用有助于理解H.pylori胃炎的发病机制,并可为相关胃病的防治提供新的思路和理论依据。H.pylori相关胃癌造成了极大的社会负担。据WHO全球肿瘤数据库的资料显示:在我国,可归因为H.pylori感染的胃癌病例数大约占全球归因于H.pylori感染的癌症病例数的40%。然而,H.pylori感染促进胃癌发生发展的致病机制仍然没有被很好的阐释。胃癌转移是患者不良预后的主要原因。而肿瘤转移需要肌动蛋白骨架的动态重排,这也是H.pylori感染后宿主细胞的重要特征。肌动蛋白骨架的动态重排过程可以被多种肌动蛋白结合蛋白（Actin-binding proteins,ABPs）所调节。L-plastin是一种重要的交联和稳定F-actin的ABP。当肌动蛋白聚合发生时,L-plastin插入新合成的F-actin中并稳定这些结构,而基于此,L-plastin在细胞与细胞相互作用、整合素粘附和细胞的迁移运动中具有重要的作用。正常生理情况下,L-plastin只在造血细胞内表达,然而,在多种非造血来源的癌细胞中亦有L-plastin的异位表达。目前,L-plastin在H.pylori相关胃癌中的表达模式,调控机制以及其所发挥的功能仍不知。阐明H.pylori感染调控胃癌细胞内L-plastin表达的分子机制以及功能作用,有助于丰富H.pylori感染的致病机理,并为寻找阻断胃癌进展的疗法提供新的思路和理论依据。研究目的:1.研究ETS1在H.pylori胃炎中的表达模式、调控机制和功能作用。2.研究L-plastin在H.pylori相关胃癌中的表达模式、调控机制和功能作用。研究方法:第一部分:ETS1在H.pylori胃炎中的表达、调控和功能作用研究1.ETS1在H.pylori胃炎中的表达模式研究（1）qRT-PCR、蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）以及免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）实验检测人胃黏膜组织中ETS1表达情况。（2）构建H.pylori感染动物模型（C57小鼠）,并通过qRT-PCR、WB和IHC实验检测小鼠胃黏膜组织中ETS1表达情况。（3）GEO数据库芯片和RNA-seq实验分析H.pylori感染对ETS转录因子家族分子表达的影响。（4）qRT-PCR和WB实验检测H.pylori感染细胞模型中ETS1的表达情况。2.ETS1在H.pylori胃炎中的调控机制研究（1）qRT-PCR和WB实验检测Traswell感染模型和细胞毒素相关基因A（Cytotoxin-associated gene A,cag A）蛋白敲除菌株（Δcag A）感染细胞模型中ETS1的表达情况。（2）qRT-PCR和WB实验检测信号通路阻断剂BAY 11-7082对H.pylori诱导ETS1表达的影响。（3）双荧光素酶报告基因实验检测H.pylori对ETS1启动子活性的影响。（4）基于PROMO网站,分析p65在ETS1启动子区域内的结合位点;染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）实验验证p65是否对ETS1的表达具有直接调控作用。（5）qRT-PCR和WB实验检测IFN-γ,IL-17A,IL-22,IL-6,IL-12,IL-23,IL-1β和TNFα对H.pylori诱导ETS1表达的影响以及机制。3.ETS1在H.pylori胃炎中的功能作用研究（1）siRNA沉默实验以及转录组测序（RNA-seq）实验,分析在H.pylori感染状态下ETS1调控的靶基因,进而分析ETS1发挥的作用。（2）根据H.pylori感染的胃炎标本的组织病理学评价标准,将人体胃黏膜标本分为轻度,中度和重度胃炎,并评价ETS1的表达与炎症程度的关系。第二部分:L-plastin在H.pylori相关胃癌中的表达、调控和功能作用研究1.L-plastin在H.pylori相关胃癌中的表达模式研究（1）通过KEGG数据库,GEPIA网站、表达谱芯片以及IF双染实验筛选在H.pylori相关胃癌中具有重要作用的肌动蛋白结合蛋白。（2）qRT-PCR和WB实验检测H.pylori感染胃癌细胞系和原代胃癌细胞（Ep CAM+）模型中L-plastin的表达情况。（3）采用qRT-PCR、WB、IHC以及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）双染实验检测胃癌组织内L-plastin的表达情况。2.H.pylori调控胃癌细胞内L-plastin表达的机制研究（1）qRT-PCR和WB实验检测Traswell感染模型和Δcag A感染胃癌细胞系和原代胃癌细胞（Ep CAM+）模型中L-plastin的表达情况。（2）信号通路阻断剂预处理胃癌细胞,之后,使用H.pylori NCTC 11637或者Δcag A感染,采用qRT-PCR实验实验检测L-plastin的表达情况,并使用WB实验检测L-plastin以及信号通路关键蛋白的表达情况。（3）将表达cag A蛋白的质粒（cag A-pc DNA3.1）转染胃癌细胞,采用qRT-PCR实验检测L-plastin的表达情况,采用WB实验检测L-plastin以及信号通路关键蛋白表达情况。（4）双荧光素酶报告基因实验检测H.pylori对L-plastin启动子活性的影响,并寻找L-plastin启动子关键反应区域。（5）基于PROMO网站,分析SP1在L-plastin启动子关键反应区域内的结合位点;并通过siRNA干扰和Ch IP实验验证SP1是否对L-plastin的表达具有直接调控作用。3.H.pylori调控胃癌细胞内L-plastin表达的功能作用研究（1）使用慢病毒构建稳定过表达L-plastin的细胞株（LV5-L-plastin）以及其对照（LV5-NC）,采用qRT-PCR和WB实验检测L-plastin的过表达效果。（2）构建慢病毒介导的稳定沉默L-plastin的细胞株（LV3-sh L-plastin）以及其对照（LV3-NC）,并使用H.pylori NCTC 11637进行感染,采用qRT-PCR和WB实验检测L-plastin的表达情况。（3）在体外,使用LV5-L-plastin细胞和庆大霉素处理的H.pylori NCTC 11637感染的LV3-sh L-plastin细胞进行Transwell实验,检测细胞迁移能力的变化。（4）在体内,使用LV5-L-plastin细胞和LV5-L-plastin细胞构建裸鼠肺转移模型,评价L-plastin对胃癌细胞迁移的影响。研究结果:第一部分:ETS1在H.pylori胃炎中的表达、调控和功能作用研究1.ETS1在H.pylori胃炎中的表达模式研究（1）qRT-PCR、WB和IHC实验结果显示:相较未感染胃组织,H.pylori感染患者胃组织中,ETS1表达显著增加。同时,IHC结果显示:在H.pylori感染后,胃上皮细胞表达ETS1上调。（2）qRT-PCR结果显示:ETS1在H.pylori感染的小鼠胃组织中的表达呈现动态变化,并在感染后12周达到高峰;qRT-PCR、WB和IHC实验结果均显示:相较未感染胃组织,H.pylori感染小鼠胃组织中,ETS1的表达显著增加。同时,IHC结果亦显示:在H.pylori感染后,胃上皮细胞表达ETS1上调。（3）GEO数据库芯片和RNA-seq结果显示:H.pylori感染胃上皮细胞后,有多个ETS转录因子家族的基因表达发生显著性变化,而ETS1表达升高最为显著。（4）qRT-PCR和WB实验结果显示:随着H.pylori感染时间的延长（0h,6 h,12 h和24 h）或MOI（0,50,100和200）的增加,ETS1的表达亦出现增加的趋势。2.ETS1在H.pylori胃炎中的调控机制研究（1）Traswell感染实验结果显示,相较未直接接触,H.pylori与细胞的直接接触可以显著的诱导ETS1的表达。cag A蛋白敲除菌株（Δcag A）感染细胞结果显示:ETS1的诱导表达仅在H.pylori NCTC 11637感染后增加,而在Δcag A感染后不增加。（2）qRT-PCR和WB结果显示:BAY 11-7082阻断剂能够抑制H.pylori诱导的ETS1表达。（3）双荧光素酶报告基因实验显示,H.pylori感染可以激活ETS1的启动子。（4）PROMO网站显示,ETS1的启动子区含有2个p65的结合位点（第一个位点:-1568至-1558,GCTTTTCCCAG;第二个位点:-373至-363,GACTTTCCCGA）。Ch IP实验显示,转录因子p65可以直接与ETS1启动子结合,进而介导ETS1表达。（5）炎性细胞因子协同H.pylori或单独刺激细胞实验显示:仅有IL-1β和TNFα能够协同H.pylori诱导ETS1的表达,同时,IL-1β和TNFα均可以单独诱导ETS1的表达。信号通路阻断剂BAY 11-7082预处理细胞,之后,使用炎性细胞因子进行刺激,结果显示:该阻断剂可以显著的抑制IL-1β和TNFα诱导的ETS1的表达。3.ETS1在H.pylori胃炎中的功能作用研究（1）在H.pylori感染状态下,共有75个转录本可以被ETS1正向调控,其中,可以编码蛋白质的转录本有39个。对排名前30位的基因进行Gene-ontology分析,结果显示:ETS1参与的主要生物学过程包括:正向调控细胞迁移、细胞运动、细胞内成分的运动、炎症应答、淋巴细胞的迁移和淋巴细胞的运动。（2）将H.pylori患者胃炎标本分为轻度,中度和重度,发现随着胃炎严重程度增加,ETS1的表达亦增加。第二部分:L-plastin在H.pylori相关胃癌中的表达、调控和功能作用研究1.L-plastin在H.pylori相关胃癌中的表达模式研究（1）基于KEGG数据库,共找到了193个ABPs;GEPIA网站显示,有48个ABPs在胃癌组织中表达显著升高;表达谱芯片结果显示:H.pylori NCTC 11637感染AGS细胞后,L-plastin表达上调最显著。IF实验结果显示:在H.pylori感染后,L-plastin表达增加,并且与actin存在共定位。（2）qRT-PCR和WB实验结果显示:H.pylori感染胃癌细胞系（AGS和HGC-27）和原代胃癌细胞（Ep CAM+）,均会显著上调L-plastin表达。此外,随着感染时间的延长（0h,6 h,12 h,24 h和36 h）或MOI（0,10,20,50,100和200）的增加,L-plastin的表达亦出现增加的趋势。（3）qRT-PCR、WB和IHC实验均显示:相较未感染的胃癌患者,H.pylori感染的胃癌患者的胃癌组织中,L-plastin在m RNA和蛋白水平表达均增加。同时,IHC结果亦显示:在H.pylori感染的胃癌患者的胃癌组织中,胃癌细胞表达L-plastin上调。IF双染实验结果显示:在H.pylori感染的胃癌患者的胃癌组织中,L-plastin同Ep CAM存在共定位。2.H.pylori调控胃癌细胞L-plastin表达上调的机制研究（1）Traswell感染实验结果显示,相较未直接接触,H.pylori与细胞的直接接触可以显著的诱导L-plastin的表达。Δcag A菌株感染细胞结果显示:L-plastin的诱导表达仅在H.pylori NCTC 11637感染后增加,而在Δcag A感染后不增加。（2）qRT-PCR和WB实验结果显示:使用U0126阻断剂阻断ERK信号通路,可以显著的抑制H.pylori诱导的L-plastin表达。WB结果显示:相较Δcag A感染,H.pylori NCTC11637感染可以显著的诱导ERK1/2发生磷酸化。（3）qRT-PCR和WB实验结果显示:将表达cag A蛋白的质粒（cag A-pc DNA3.1）转染胃癌细胞后,其会显著的激活ERK信号通路,并上调L-plastin的表达。（4）双荧光素酶报告基因实验显示:H.pylori感染诱导胃癌细胞内L-plastin表达上调的关键启动子反应区域在转录起始点上游100bp内。（5）PROMO分析显示:在L-plastin的启动子区（-100到0）包含SP1结合位点（GGGGCGGGGA）。之后,在H.pylori感染状态下,使用siRNA将SP1表达抑制。同预期相符:抑制SP1表达后,H.pylori便不能有效的诱导L-plastin的表达。Ch IP实验结果显示:与未感染和Δcag A感染相比,H.pylori NCTC 11637可以有效的促进SP1结合至L-plastin的启动子区,然而,这种结合会被U0126所抑制。3.H.pylori调控胃癌细胞L-plastin表达上调的功能作用研究（1）WB实验结果显示:相较LV5-NC,LV5-L-plastin细胞能够过表达L-plastin。（2）WB实验结果显示:相较庆大霉素处理的H.pylori NCTC 11637感染的LV3-NC细胞,庆大霉素处理的H.pylori NCTC 11637感染的LV3-sh L-plastin细胞表达L-plastin显著降低。（3）体外Transwell实验结果显示:相较LV5-NC,过表达L-plastin后,细胞迁移数量明显增多;而相较庆大霉素处理的H.pylori感染的LV3-NC细胞,庆大霉素处理的H.pylori感染的LV3-sh L-plastin细胞迁移数量明显减少。（4）体内裸鼠肺转移模型显示:相较对照组（LV5-NC）,过表达L-plastin后,小鼠的肺部肿瘤结节显著增多;而抑制L-plastin的表达后,出现肺部肿瘤结节的小鼠数量显著少与对照组。研究结论与意义:第一部分:ETS1在H.pylori胃炎中的表达、调控和功能作用研究1 H.pylori感染诱导胃上皮细胞内ETS1表达2.H.pylori cag A激活的NF-κB信号通路通过p65直接调控ETS1表达;并且IL-1β和TNFα可以通过激活NF-κB信号通路协同H.pylori诱导ETS1表达。3.H.pylori感染诱导的ETS1具有促进炎症的作用。4.本研究提示ETS1可能参与了H.pylori介导的“炎-癌”转化,从而使ETS1成为具有潜力的抑制胃炎进展的靶点。第二部分:L-plastin在H.pylori相关胃癌中的表达、调控和功能作用研究1.H.pylori感染诱导胃癌细胞表达L-plastin上调。2.H.pylori cag A激活ERK/SP1通路介导L-plastin的表达。3.H.pylori诱导的L-plastin促进胃癌细胞的转移。4.本研究提示L-plastin可作为抑制H.pylori相关胃癌进展的潜在治疗靶点。