研究背景及意义胆管癌(cholangiocarcinoma)是一种起源于胆道上皮的高度恶性的肿瘤。在第七版美国癌症联合委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)的分类中,胆管癌可以通过其发生部位进一步分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma)、肝门部胆管癌(perihilar cholangiocarcinoma)和远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma)。肝内胆管癌、肝门部胆管癌和远端胆管癌分别起源于肝内、肝门部和远端胆管上皮,且分别具有不同的肿瘤生物特征和临床特性。在AJCC/UICC的TNM分类中,根据肿瘤的大小、浸润、淋巴结及远处转移等临床特征又可将肝内、肝门部、远端胆管癌详细分为TNM的4期。有流行病学调查认为,肝门部胆管癌是最常见类型的胆管癌,其次是远端胆管癌,然后是肝内胆管细胞癌。胆管癌的发病率只占消化道恶性肿瘤的3%,但其发病率和死亡率,尤其是肝内胆管细胞癌,近年来在全球范围内持续增加。胆管癌的发病率在美国大约是每年增加大于9760确诊新病例,但是其死亡率是非常高的。目前,肿瘤的根治性切除和肝脏移植是已知的根治性治疗胆管癌的方法,但是当患者由于黄疸或腹部疼痛而住院时,由于胆管癌早期淋巴结浸润及远端转移的特点,患者可能已经失去最佳手术时机,导致根治性切除率比较低且不稳定(18-70%)。总之,大部分病人因为胆管癌的临床特征不明显,早期诊断困难,易发生淋巴结和远端转移,以及对辅助治疗的低敏感性等特点,可能在明确诊断时已经失去了手术指证,这导致胆管癌的5年生存率很低,只有5%到15%左右。综上所述,胆管癌难于根治切除及预后极差的原因是一系列的,包括临床症状不明显、早期诊断困难、易淋巴结及远端转移、易复发、对辅助治疗不敏感等。因此,对于胆管癌而言,新的预测性的、预后性的或者治疗性的肿瘤标志物是非常重要的,但是目前对于胆管癌预后标志物的研究还是很少。尽管近年来胆管癌的分子生物学研究和分析上取得了很大的进展,但是在新的肿瘤标志物研究方面仍然是进展缓慢。这和胆管癌的临床特点有一定关系,大部分病人在明确诊断时已经处于难以切除的阶段,失去手术指证,给肿瘤的取材以及大规模的临床调查研究带来了很大困难。因此对于胆管癌的发生、发展、预后及潜在抑制剂方面的基础及临床研究都不够。但是这方面的研究对胆管癌的治疗能起到直接的指导作用,如乳腺癌中表皮生长因子受体2(ErbB2)和乳腺癌预后的关系的发现催生了ErbB2特异性单克隆抗体赫赛汀(Herceptin)的发明,这使得相当部分的乳腺癌患者生存期大大延长及生活质量大大提高,由此可见肿瘤预后标志物研究对于肿瘤治疗的重大意义。我们希望我们对于胆管癌肿瘤标志物的筛选和研究能够对胆管癌的进展的研究有所启发,能够帮助寻找胆管癌的新的药物和疗法。最近在肝内胆管癌的肿瘤标志物和分子生物学分类领域上有较为重大的突破,通过高通量的基因标记和分子生物学分析,胆管癌的转录谱及表达谱的分类得以揭示。Daniela等人通过基因组分析和分子标志将肝内胆管癌分为2类,即增殖型和炎症型。增殖型有特别的基因突变的拷贝数,原癌基因信号通路的异常激活,并且具有较差的预后。在肝内胆管癌,基于分子水平的特异性的分析,提示对于不同分子类型胆管癌要采取不同治疗手段。基于近期在胆管癌的分子生物学和临床研究上的重大突破,我们系统性阅读了关于可能影响胆管癌的预后生存时间的肿瘤标志物的基因组学和蛋白组学的高质量论文,尤其是关注其关于胆管癌组织和非胆管癌组织的高通量筛选实验结果,包括基因芯片(gene microarray)研究、快速扫描质谱研究、高通量基因测序研究等。通过这些己发表的高通量实验结果,结合己知的可能影响胆管癌进展或预后的信号通路研究,我们有目的地挑选大约30种胆管癌的候选肿瘤标志物,并且在组织芯片上通过免疫组织化学染色的技术方式对这些肿瘤标志物进行了初步筛选。这些肿瘤标志物包括已知有明显预后意义的肿瘤标志物和待进一步筛选的标志物。已知有明显预后意义的肿瘤标志物包括血管表皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体1(EGFR);待筛选的肿瘤标志物包括：(1)生长因子受体类：纤维生长因子受体1(FGFR1)、纤维生长因子受体2(FGFR2)、纤维生长因子受体3(FGFR3)、纤维生长因子受体4(FGFR4)、人表皮生长因子受体2(ErbB2)、人表皮生长因子受体3(ErbB3)、胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)、神经生长因子酪氨酸激酶受体A(TrkA),(2)生长因子类：纤维生长因子1(FGF1)、纤维生长因子19(FGF19)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF),(3)炎症因子类：白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10),(4)转录因子类：信号转导和转录激活因子3(Stat3)、磷酸化信号转导和转录激活因子3(phospho-stat3)、转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)、转录因子Foxol、转录调节因子ETS-1蛋白(ETS-1),(5)泛素化相关蛋白类：F-box蛋白9(FBOX9)、WD重复和FYVE结构域蛋白1(WDFYl)。初步筛选后,我们用免疫组化的方法在组织芯片上研究这些候选蛋白在胆管癌组织中的表达,并且选取了表达水平较高的候选标志物,通过Kaplan-Meier方法对候选肿瘤标志物对预后的影响进行了单因素分析以进一步筛选有预后意义的标志物。选取后用卡方检验的方法研究这些标志物和临床病理特征的关系,并通过Cox回归模型进行了多因素分析以确定标志物是否具有独立预后意义。通过我们的筛选和预后分析,我们最终确定FGFR4的阳性表达在肝内胆管癌和肝门部胆管癌有不良的预后作用,以及NGF/TrkA的双阳性表达在肝内胆管癌中和预后不良有明显关系。为了解释FGFR4和NGF/TrkA的阳性表达对胆管癌预后的不良影响,我们设计并实施了一系列的胆管癌细胞水平的体外实验,包括胆管癌细胞信号通路激活的检查、增殖检测、侵袭检测、凋亡检测、上皮-间充质转变的检测等。通过这些体外实验我们发现FGF19/FGFR4信号通路的激活能够明显促进胆管癌细胞的增殖、侵袭和上皮-间充质转变,而且FGFR4的小分子抑制剂能够明显抑制胆管癌细胞增殖和侵袭,并诱导胆管癌细胞的凋亡。NGF/TrkA信号的激活能通过激活MAPK信号途径和PI3K/AKT信号途径显著促进肝内胆管癌细胞系的增殖和侵袭。整个论文分为三大部分。第一部分：我们收集了山东大学齐鲁医院和临沂市沂水中心医院共280例罹患胆管癌病人的病理和临床资料,分为了初始队列(primary cohort)和验证队列(validation cohort),通过随访得到病人的预后生存时间,在病人家属知情同意的基础上,取得了病理组织标本并制作成组织芯片(TMA),通过免疫组化的方式确定候选标志物在胆管癌中的表达比例,并分析了候选标志物和临床病理特征(clinicopathologic parameters)及生存时间的关系(survival time),并以此确定了FGFR4和NGF/TrkA可能导致胆管癌的不良预后。第二部分：我们对FGFR4在胆管癌的发展和预后中的作用进行了集中研究。通过单因素和多因素分析证明FGFR4阳性表达在肝内胆管癌和肝门部胆管癌中是独立预后因子,进而通过一系列体外胆管癌细胞系实验证明FGFR4的激活能够明显促进胆管癌细胞系的增殖、迁移和上皮-间充质转变(EMT),FGFR4抑制剂AP24354能够明显抑制胆管癌细胞的增殖侵袭并诱导其凋亡。第三部分：我们证明NGF/TrkA的双阳性表达在肝内胆管癌中有独立的预后意义,并且通过肝内胆管癌细胞系的体外实验证明NGF/TrkA信号通路的激活能够活化MAPK/Erk/P38信号通路及PI3K/AKT信号通路,并且可以以此促进肝内胆管癌细胞系的增殖和侵袭。第一部分胆管癌肿瘤标志物的免疫组化筛选目的检测候选标志物在胆管癌组织芯片中的表达情况,选取高表达的标志物分析其阳性表达和生存时间及生存率的关系。方法首先我们收集了山东大学齐鲁医院和临沂市第二人民医院2002到2010年的共计280例胆管癌患者病理和临床资料,并且通过电话随访的方式获得了患者的术后生存资料。在患者家属知情并同意基础上,选取199例胆管癌病理标本并制作了组织芯片。在近期胆管癌的蛋白组学和分子生物学研究的预测中,我们选取了可能的候选肿瘤标志物,包括(1)生长因子受体类：纤维生长因子受体1(FGFR1)、纤维生长因子受体2(FGFR2)、纤维生长因子受体3(FGFR3)、纤维生长因子受体4(FGFR4)、人表皮生长因子受体2(ErbB2)、人表皮生长因子受体3(ErbB3)、胰岛素样生长因子受体1(IGF1R)、神经生长因子酪氨酸激酶受体A (TrkA),(2)生长因子类：纤维生长因子1(FGF1)、纤维生长因子19(FGF19)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF),(3)炎症因子类：白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10),(4)转录因子类：信号转导和转录激活因子3(Stat3)、磷酸化信号转导和转录激活因子3(phospho-stat3)、转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)、转录因子Foxol、转录调节因子ETS-1蛋白(ETS-1),(5)泛素化相关蛋白类：F-box蛋白9(FBOX9)、WD重复和FYVE结构域蛋白1(WDFY1)。并用免疫组化方法(IHC)检测了这些肿瘤标志物在胆管癌组织芯片中的表达情况。选取阳性表达率较高的标志物,先通过单因素分析验证阳性表达和预后生存时间的关系,单因素分析中有预后意义的标志物再通过卡方检验验证阳性表达和临床病理特征的关系,并通过多因素分析验证阳性表达是否是胆管癌的独立预后因子。结果通过组织芯片上对候选肿瘤标志物的免疫组化分析,我们发现在选取的20余种候选蛋白中,阳性表达率高于20%的标志物有VEGF、EGFR、FGFR1、 FGFR2、FGFR4、FGF19、ErbB3、NGF、TrkA、FOXO1和CREB。通过对标志物阳性表达和预后生存率的单因素分析,我们发现阳性表达具有预后意义的只有VEGF、EGFR、FGFR4以及NGF/TrkA的双阳性。结论阳性表达率高于20%的标志物有VEGF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR4、 FGF19、ErbB3、NGF、TrkA和CREB。单独阳性表达具有预后意义的只有VEGF、 EGFR和FGFR4。对于FGFR4、NGF/TrkA阳性表达在胆管癌中独立预后意义,以及导致不良预后的可能机制需进一步研究。第二部分FGFR4信号通路对胆管癌进展和预后相关性的临床及机制研究目的纤维生长因子受体4(FGFR4)已经被证明在多种肿瘤的发生有关,但是FGFR4和胆管癌的关系尚未有报道。本研究旨在探索FGFR4表达在胆管癌中的预后作用以及FGFR4在胆管癌进展中起到的作用。方法83例肝内胆管癌、75例肝门部胆管癌和41例远端胆管癌的标本被制作成组织芯片。在芯片上通过免疫组化方法检测了FGFR4的表达情况,并通过卡方检验进一步分析了FGFR4表达和临床病理特征的关系。我们通过Kaplan-Meier方法分析了FGFR4阳性表达对肿瘤预后的影响,选取单因素表达中有意义的标志物并进一步通过Cox回归模型确定其是否有独立预后意义。结果FGFR4的阳性表达率在肝内胆管癌为61.4%(51/83),在肝门部胆管癌为36.7%(35/75),在远端胆管癌为56.1%(23/41)。在单因素分析中,FGFR4与肝内胆管癌(P=0.002)和肝门部胆管癌(P=0.019)的预后生存时间明显相关。在多因素分析中,FGFR4被鉴定为肝内胆管癌(P=0.045)和肝门部胆管癌(P=0.049)的独立预后因子。通过体外细胞实验,我们验证了FGFR4在肝内胆管癌,肝门部胆管癌细胞系的表达,并且发现FGFR4能够促进肝内胆管癌细胞系RBE,肝门部胆管癌细胞系QBC939的增殖,侵袭和上皮-间充质转变(EMT)。我们证明FGFR4的小分子抑制剂AP24354能够显著降低FGF19引起的RBE细胞的增殖和侵袭,并且一定浓度的AP24354能够诱导RBE细胞的凋亡。结论纤维生长因子受体FGFR4在胆管癌中表达较高,并且FGFR4高表达是肝内胆管癌和肝门部胆管癌的独立预后因子。FGFR4能够促进胆管癌细胞系的增殖侵袭和上皮-间充质转变。FGFR4小分子抑制剂AP24354能够显著抑制胆管癌细胞的增殖,侵袭并且诱导胆管癌细胞凋亡。这为胆管癌的分子靶向治疗提供了新的启发。第三部分NGF-TrKA信号通路对胆管癌进展及预后相关性的临床及机制研究目的肿瘤生长因子(NGF)及其受体TrKA在多种肿瘤的发生和进展过程的作用都有报道,但是NGF-TrkA信号通路在胆管癌中的作用尚未得到阐述。我们的实验揭示了NGF-TrkA信号通路在胆管癌的进展和预后中的作用。方法83例肝内胆管癌、75例肝门部胆管癌和41例远端胆管癌组织被制成组织芯片(TMA),用以通过免疫组化方法检验NGF和TrKA在胆管癌中的表达。我们对NGF和TrKA的表达与临床病理特征的关系通过卡方检验进行了分析,并且通过单因素分析和多因素分析对NGF和TrKA的表达对预后生存率的关系进行了分析。通过胆管癌细胞系的体外实验,我们证明在合成的生长因子NGF-β刺激下,NGF-TrKA信号通路能够在肝内胆管癌的增殖和迁移起到重要作用。结果肝内胆管癌中,NGF和TrkA的表达与肿瘤分化(P=0.024)和神经浸润(P=0.003)明显相关。NGF和TrkA双阳性表达并鉴定为肝内胆管癌的独立预后因子。而且我们证明NGF-TrKA信号通路能够显著促进肝内胆管癌细胞系的增殖和迁移。结论NGF-TrkA双阳性表达是肝内胆管癌的独立预后因子。NGF-TrkA信号通路能够促进肝内胆管癌细胞系的增殖和迁移。这预示NGF-TrkA信号通路可能成为肝内胆管癌治疗的靶位点。