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第一部分新型载药基台在种植体周围炎症预防和治疗中的作用研究实验一载药基台的设计制备与表面分析研究目的:设计并制备可以用于牙种植体局部组织给药的载药基台,并对其表面形貌及粗糙度进行检测。材料和方法:载药基台由三部分构成,包括上部的储药仓、下部的连接部和用来封闭储药仓的封盖。储药仓为下端封闭的中空圆柱体,其中空部分形成用来载药的仓体,周壁的下2/3段均匀分布有圆形药物流通孔。下部连接部通过螺纹结构与前期植入的牙种植体连接。根据药物流通孔大小的不同,利用医用纯钛棒分别制备药物流通孔孔径为0.3mm、0.5mm和0.8mm的载药基台和普通愈合基台。利用扫描探针显微镜检测载药基台和普通愈合基台表面形貌及粗糙度。实验结果:载药基台和普通愈合基台表面形貌相似,呈现较典型的钛金属表面形貌,两种基台表面粗糙度无显著性差异,均小于0.2μm。结论:本实验成功完成不同药物流通孔孔径大小的载药基台和普通基台的设计和制备,基台表面特性符合应用于牙种植体系统的要求。实验二载药基台系统体外抑菌作用研究研究目的:体外环境下,观察载药基台系统对口腔常见细菌及种植体周围炎症相关致病菌的抑菌作用。材料和方法:培养并鉴定变异链球菌、血链球菌、牙龈卟啉单胞菌,以三种细菌为待测菌,将细菌悬液均匀涂抹于培养基平板表面,平板中央打孔,将载有米诺环素软膏的载药基台置于其中,24小时后观察不同大小流通孔孔径的载药基台在三种细菌培养平板上的抑菌环形成情况,记录并比较抑菌环的大小。以变异链球菌和血链球菌为待测菌,将载有米诺环素软膏的0.5mm流通孔孔径的载药基台置于平板中央,每24h更换平板,观察在不同观察时间点(1-7天)的抑菌环形成情况。实验结果:将基台置于三种细菌培养平板24h后,三组不同大小药物流通孔孔径的基台周围均出现抑菌环,随着载药基台流通孔的增大,三种基台周围抑菌环的直径也显著增大。在置入流通孔孔径为0.5mm载药基台后的第1天到第7天,两种细菌培养平板上均有抑菌环形成。结论:体外环境下,载药基台具有良好的药物流通性,流通孔孔径为0.5mm的载药基台具有持续释放药物的能力。实验三载药基台系统对种植体植入早期菌斑形成的影响研究研究目的:体内环境下,观察载药基台系统在种植体植入后早期对菌斑形成和累积的影响。材料和方法:设计并制备牙种植体,以比格犬为实验动物,拔除其双侧下颌第三、第四前磨牙和第一磨牙,12周后建立种植体植入模型,种植体上部分别连接载有米诺环素软膏的0.5mm流通孔孔径载药基台,不载药物的0.5mm流通孔孔径载药基台和普通愈合基台,停止口腔卫生维护,种植体植入一周后,对三组基台表面进行菌斑染色并定量检测菌斑含量。实验结果:种植体植入一周后,菌斑染色结果显示载有米诺环素软膏的载药基台基台表面染色菌斑面积明显小于不载药物载药基台和普通愈合基台组。定量检测结果与染色结果一致。不载药物载药基台和普通愈合基台组无明显差异。结论:本实验动物模型中,在种植体植入早期,载药基台可以有效将药物释放到种植体周围组织,减少菌斑形成和累积,提示载药基台可能应用于种植体周围炎症疾病的预防。实验四载药基台系统对种植体周围炎症进展的影响研究研究目的:体内环境下,观察载药基台系统对种植体周围炎症进展过程的影响。材料和方法:以比格犬为实验动物,植入种植体12周后以丝线结扎法建立种植体周围炎症模型,结扎的同时将种植体上部分别连接载有米诺环素软膏的载药基台(实验组)和普通愈合基台(对照组),在丝线结扎前及结扎后的第2、4、8周进行临床检查,记录种植体周围探诊出血指数(Bleeding on probing,BOP)、种植体周围探诊深度(Peri-implant probing depth,PPD)、种植体周围龈沟液(PICF)量、PICF中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及碱性磷酸酶(ALP)活性、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-1β(IL-1β)含量。在结扎前及结扎后第8周进行X线检查,记录X线片上每颗种植体近中和远中处种植体颈缘与边缘骨水平(MBL)的距离。结合临床检查和X线检查结果,观察连接两组基台的种植体周围组织炎症进展情况。实验结果:丝线结扎后,实验组和对照组BOP、PPD、PICF的量、PICF中AST、ALP、TNF-α和IL-1β的水平均呈现增加趋势,两组相比较,实验组BOP、PPD、PICF体积、AST和IL-1β水平的增加量显著小于对照组。X线检查显示两组均出现骨吸收,骨吸收水平无明显差异。结论:在本实验动物模型中,载药基台药物释放体系可以有效减缓实验性种植体周围炎症的进展过程,本系统可能在种植体周围炎症治疗和种植体周相关药物研发中具有潜在应用价值。第二部分TNFR1-PLAD作为抗TNF药物治疗种植体周围炎症的可能性初探实验一TNFR1-PLAD载体的构建及在人牙龈成纤维细胞中的过表达研究目的:体外构建pCDH-TNFR1-PLAD过表达质粒,通过慢病毒载体转染人牙龈成纤维细胞(HGF),观察TNFR1-PLAD基因在HGF中的表达。材料和方法:采用组织块法培养人牙龈成纤维细胞(HGF)并进行鉴定。通过双酶切方法,在p CDH表达质粒中插入人工合成TNFR1-PLAD基因片段,构建p CDH-TNFR1-PLAD过表达质粒。采用三质粒体系,包装浓缩慢病毒并转染HGF。以TNFR1-PLAD病毒转染的HGF为实验组,以空质粒p CDH病毒转染的HGF和未经病毒转染的HGF为对照组,通过PCR和Western Blot分别检测TNFR1-PLAD在HGF细胞中的基因水平和蛋白水平的表达。实验结果:荧光显微镜观察结果提示慢病毒成功转染HGF,普通PCR和q RT-PCR结果表明实验组TNFR1-PLAD基因水平表达显著高于对照组,Western Bolt在实验组细胞内成功检测到TNFR1-PLAD蛋白,含量明显高于对照组。结论:本实验成功构建p CDH-TNFR1-PLAD质粒,并通过慢病毒载体实现其在人牙龈成纤维细胞(HGF)中的持续过表达。实验二炎症环境下过表达TNFR1-PLAD对人牙龈成纤维细胞的生物学影响研究目的:研究在炎症环境下,过表达TNFR1-PLAD对HGF的生物学影响。材料和方法:以TNFR1-PLAD病毒转染的HGF为实验组,以空质粒p CDH病毒转染的HGF和未经病毒转染的HGF为对照组。给予三组细胞TNF-α(10ng/ml)刺激,5min后,提取细胞总蛋白,Western Blot检测细胞NF-κB通路相关蛋白p65、p-p65、p-IκBα表达水平。3h后,收集细胞RNA,q RT-PCR检测细胞IL-6和IL-8基因表达水平。72h后,收集细胞上清,ELISA法检测上清中IL-6和IL-8含量。实验结果:TNF-α刺激下,过表达TNFR1-PLAD组的HGF内p-p65、p-IκBα水平明显降低,提示NF-κB通路激活水平被明显抑制。同时,PCR和ELISA结果表明过表达TNFR1-PLAD的HGF细胞内IL-6及IL-8分泌水平相对对照组显著降低。结论:TNFR1-PLAD可以特异性阻断TNFR1信号传导,抑制炎症环境下HGF中NF-κB通路的激活和相关炎症因子的分泌,可能作为一种新的TNF抑制剂,应用于牙周和种植体周围炎症的控制和治疗。实验三壳聚糖—PLAD质粒缓释微球的制备和性能检测研究目的:制备壳聚糖—PLAD质粒缓释微球并检测其性能。材料和方法:以5m M乙酸-乙酸钠缓冲液配制0.02%的壳聚糖溶液,以50m M硫酸钠溶液配制浓度100μg/ml的质粒溶液,采用复凝集法制备壳聚糖—PLAD质粒微球。利用激光动态分析仪分析微球颗粒大小及分布。采用溶菌酶降解法定量分析微球体外释药过程中的释放剂量并绘制释药曲线,同时检测微球的体外降解性能。实验结果:采用复凝集法制备壳聚糖—PLAD质粒微球平均粒径为811.4±85.93nm,微球的包封率为92.7±2.2%,载药率为18.5±1.7%。微球释放性能良好,同时具有缓慢降解的特性,在第21天,降解率为57.74±3.78%。结论:本实验通过复凝集法,成功制备壳聚糖—PLAD质粒微球,体外性能检测显示其具有合适的颗粒大小,良好的载药释药性能及缓慢降解特性。