鸡球虫病是由一种或数种艾美耳球虫寄生于鸡消化道上皮细胞内引起的一种寄生原虫病,严重危害养鸡业,在我国每年仅用于该病的防治费用就达3～6亿元。长期以来,该病的防治主要依赖药物。但随着药物的长期使用,引起耐药性虫株普遍出现,使药物防治效果不断下降。此外,抗球虫药在饲料中的长期添加,还导致药物残留肉蛋,污染环境,危害人类健康。因此,迫切需要寻找新的策略或方法来控制鸡球虫病。毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)是7种鸡球虫中致病性最强的球虫之一,主要危害8～18周龄的鸡,引起急性小肠球虫病。艾美耳球虫的生活史包括裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖三个发育阶段,裂殖生殖又有不同的繁殖代数。一般认为艾美耳球虫的生长发育与性别分化受制于不同发育阶段的基因差异表达与调控。球虫各阶段虫体的分离纯化很难,因此也制约了球虫分子生物学研究领域的发展。艾美耳球虫发育的相关研究国内外文献报道很少,尤其是有关毒害艾美耳球虫的不同发育阶段的分子学研究国内外尚无有关报道。毒害艾美耳球虫的裂殖生殖包括三代,第一、二代裂殖生殖发生在小肠中段的肠黏膜上皮细胞内,第三代裂殖生殖和配子生殖发生在盲肠黏膜上皮细胞内,易于虫体鉴别与分离。本文分离与纯化了毒害艾美耳球虫的第二、三代裂殖子和配子体,提取总RNA后采用第二代测序技术分别对这3个发育阶段虫体的mRNA进行测序,获得转录组数据;对转录组数据进行比较分析,筛选不同发育阶段虫体的差异表达基因,并进行实时定量PCR验证、功能注释与代谢通路富集分析;最后,对4个差异表达基因进行原核表达与免疫荧光定位,对其中1个重组蛋白进行了动物免疫保护试验。本文通过毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子和配子体3个发育阶段的转录组测序和比对分析,获得了3个发育阶段的差异表达基因,而对艾美耳球虫不同发育阶段差异表达基因的研究,不仅可以解析艾美耳球虫生长发育的的分子基础与机制,而且可能寻找到药物或疫苗免疫的靶点,从而为鸡球虫病的防治提供新途径和新方法。一、毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子和配子体的分离与纯化用毒害艾美耳球虫孢子化卵囊经嗉囊接种无球虫感染雏鸡后,从鸡小肠中段黏膜组织中分离第二代裂殖子,最后采用Percoll密度梯度离心法纯化裂殖子,平均每只鸡获得7.25×108个裂殖子;从鸡盲肠黏膜组织中分离第三代裂殖子,最后采用DEAE-52纤维素柱层析法纯化裂殖子,平均每只鸡获得0.6×107个裂殖子。通过外科手术经盲肠直接接种第二代裂殖子后30 h,从鸡盲肠黏膜组织中分离配子体,最后采用Percoll密度梯度离心法纯化配子体,平均每只鸡获得0.5×108个配子体。二、毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子与配子体的转录组分析分别提取毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子和配子体的RNA,构建测序样本文库,进行高通量测序。分别从第二代裂殖子文库、第三代裂殖子文库和配子体文库中获得68009 332,51 854 332,73 219 844条Raw reads。比对后,第二代裂殖子共有6 977个基因注释成功,第三代裂殖子有6 901个基因注释成功,配子体有7983个基因注释成功。基因的表达分析显示,7 137个基因在3个阶段均有表达,71个基因仅在第二代裂殖子表达,61个基因仅在第三代裂殖子表达,340个基因仅在配子体表达。GO分析显示在3个发育阶段基因富集的GO条目数相近,仅在条目中的基因数有所不同。KEGG分析显示3个阶段的通路有所不同,第二代裂殖子的基因主要参与剪接体、核糖体、的合成、蛋白酶体、DNA复制、RNA转运等通路;第三代裂殖子的基因主要参与剪接体、核糖体合成、RNA转运、RNA降解、RNA聚合酶等;配子体的基因主要参与核糖体的合成、HIF-1信号通路、剪接体、突触囊泡循环、溶酶体、磷酸戊糖途径等。三、毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子比较转录组学分析比较分析每个转录本在第二代裂殖子和第三代裂殖子的表达量,发现2 053个基因表达显著差异,其中第二代裂殖子显著上调表达基因1 216个,特异性表达基因95个;第三代裂殖子显著上调表达基因837个,特异性表达基因48个。GO分析显示中有1 203个差异表达基因被成功注释到59个GO条目,GO富集分析中有1 091个差异表达基因富集在243个GO条目。KEGG分析显示,620个差异表达基因被成功注释到198条信号通路,727个差异表达基因富集到242条信号通路。四、毒害艾美耳球虫第三代裂殖子与配子体比较转录组学分析比较分析每个转录本在第三代裂殖子和配子体的表达量,发现4 267个基因表达显著差异,其中第三代裂殖子显著上调表达基因1 478个,特异性表达基因329个;第三代裂殖子显著上调表达基因2 789个,特异性表达基因1 289个。差异表达基因的GO分析显示,1 295个被成功注释到57个GO条目。KEGG分析显示,620个差异表达基因被成功注释到198条信号通路。富集分析显示,725个显著差异表达基因富集到241条信号通路。五、差异表达基因的原核表达及免疫荧光定位分析根据荧光定量PCR的验证结果,选择4个差异表达基因(EnPIPK、En4GC、EnCK2、EnHAP2),人工合成或应用RT-PCR方法克隆基因序列,并分别用原核表达载体pET28a(+)构建表达质粒,转化大肠杆菌BL21,诱导表达。融合蛋白的大小分别为30 kDa、17kDa、20 kDa、20kDa左右,均以包涵体的形式存在为主。Western blot检测显示,4种重组蛋白均能识别抗6×HIS标签单抗。分别用4种重组蛋白免疫小鼠制备的多抗进行免疫免疫荧光定位试验,结果显示EnPIPK、EnCK2和EnHAP2基因表达产物定位在第二代裂殖子(或裂殖子体)、第三代裂殖子(或裂殖体)和配子体,但在3个发育阶段表现的荧光强度不尽一致;EnAGC基因表达产物仅见于第三代裂殖子(或裂殖体)和配子体。免疫免疫荧光定位与荧光定量PCR结果相一致。六、重组蛋白rEnHAP2免疫保护效果将纯化复性的重组蛋白rEnHAP2按不同剂量(200、100、50μg/羽)免疫无球虫感染雏鸡,免疫2次后除未免疫未攻虫组外,其余各试验组雏鸡均感染毒害艾美耳球虫孢子化卵囊,以成活率、卵囊减少率、病变记分、平均增重等为指标,评价重组蛋白的免疫保护效果,并检测其诱导的细胞因子的表达水平。试验共进行2次。结果显示,rEnHAP2以每鸡200 μg的免疫剂量保护效果最好,与未免疫攻虫组相比,重组蛋白rEnHAP2能降低卵囊产量与病变记分,提高存活率;能诱导机体产生较高水平的细胞免疫和体液免疫。