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第一部分OTULIN对局灶脑缺血/再灌注大鼠脑内小胶质细胞活化和神经炎症的影响及机制研究目的1.研究OTULIN在局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血旁组织内表达的时间规律;2.探索OTULIN过表达对局灶脑缺血/再灌注大鼠是否具有神经保护作用;3.探索OTULIN对局灶脑缺血/再灌注大鼠神经炎症反应的调控作用及机制;4.探索OTULIN对小胶质细胞介导的神经炎症反应的影响及机制。方法1.SD大鼠随机分为假手术(Sham)组和模型(tMCAO)组,再灌注后6 h至72 h,采用实时定量多聚酶联反应(RT-qPCR)和免疫印迹(Western Blot)分别检测大鼠大脑皮质缺血旁组织内OTULIN mRNA和蛋白质含量。再灌注后72 h,免疫荧光观察Sham组和tMCAO组大鼠大脑皮质缺血旁组织内小胶质细胞标记物Iba-1与OTULIN蛋白共染情况。2.侧脑室转染OTULIN过表达慢病毒(LV-OTULIN),空载慢病毒(LV-Scramble)作为对照。大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(tMCAO)组、模型+LV-Scramble(tMCAO+LV-Scramble)组和模型+LV-OTULIN(tMCAO+LV-OTULIN)组。再灌注后72 h,采用Longa评分、Garcia评分和Bederson评分评价各组大鼠神经功能缺损情况,TTC染色测定脑梗死体积,免疫荧光标记NueN~+和MAP2~+神经元。3.大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(tMCAO)组、模型+LV-Scramble(tMCAO+LV-Scramble)组和模型+LV-OTULIN(tMCAO+LV-OTULIN)组,再灌注后24 h、48 h和72 h,免疫荧光观察各组大鼠非缺血侧大脑皮质和缺血侧大皮质缺血旁组织内Iba-1~+细胞。4.腹腔注射LPS建立感染性神经炎症模型。大鼠随机分为LPS(-)组、LPS(+)、LPS(+)+LV-Scramble组和LPS(+)+LV-OTULIN组。LPS注射后24 h,免疫荧光观察各组大鼠大脑皮质内Iba-1~+细胞。5.大鼠随机分为四组:手术(Sham)组、模型(tMCAO)组、模型+LV-Scramble(tMCAO+LV-Scramble)组和模型+LV-OTULIN(tMCAO+LV-OTULIN)组,再灌注后24 h采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测大脑皮质缺血旁组织内TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量,Western Blot检测p-IκBα、IκBα、细胞胞浆NF-κB p65和胞核NF-κB p65蛋白含量。6.采用经氧糖剥夺(OGD)处理的神经元培养基,即条件培养基(conditioned medium,CM)刺激原代小胶质细胞(Primary microglia,PM)和N9小胶质细胞(N9),将每种细胞各随机分为正常对照(normal control,NC)组、OGD(-)条件培养基(OGD(-)CM)组和OGD(+)条件培养基(OGD(+)CM)组,培养24 h后采用RT-q PCR和Western Blot检测各组OTULIN m RNA和蛋白含量。对NC组、OGD(-)CM组和OGD(+)CM组小胶质细胞分别转染LV-OTULIN和LV-Scramble,共计6组:NC+LV-Scramble组、NC+LV-OTULIN组、OGD(-)CM+LV-Scramble组、OGD(-)CM+LV-OTULIN组、OGD(+)CM+LV-Scramble组和OGD(+)CM+LV-OTULIN组。ELISA检测各组TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量,Western Blot检测p-IκBα、IκBα、细胞胞浆NF-κB p65和胞核NF-κB p65蛋白含量。结果1.再灌注后6 h至72 h,Sham组大脑皮质OTULIN mRNA和蛋白表达水平很低。除再灌注后6 h,余时间点t MCAO组大脑皮质缺血旁组织内OTULIN m RNA和蛋白含量较Sham组均明显增多,表达高峰在48 h。再灌注后72 h,t MCAO组OTULIN富集在活化的小胶质细胞内,而Sham组Iba-1+OTULIN+细胞非常少。2.LV-OTULIN可有效提高脑内OTULIN m RNA和蛋白表达(P<0.001)。与t MCAO组相比,t MCAO+LV-OTULIN组Longa评分(P<0.01)和Bederson评分(P<0.01)明显降低,Garcia评分(P<0.001)明显增多,脑梗死体积明显缩小(P<0.01),大脑皮质缺血旁组织内Nue N+和MAP2+细胞数量显著增多(P<0.05)。3.再灌注后各时间点,Sham组Iba-1+细胞几乎都处于静息状态。t MCAO组Iba-1+细胞在24 h主要为半激活状态,72 h以阿米巴状态为主,7 d几乎都为阿米巴形态。各特定观察时间点,t MCAO+LV-OTULIN组Iba-1平均免疫荧光强度均明显低于t MCAO组(P<0.001)和t MCAO+LV-Scramble组(P<0.001)。4.与LPS(-)组相比,LPS(+)组Iba-1平均免疫荧光强度明显升高。LPS(+)+LV-OTULIN组Iba-1平均免疫荧光强度较LPS(+)组显著降低(P<0.01)。5.再灌注后24 h,与t MCAO相比,t MCAO+LV-OTULIN组TNF-α(P<0.01)、IL-1β(P<0.05)和IL-6(P<0.01)蛋白含量明显降低,脑内NF-κB信号通路被抑制,表现为t MCAO+LV-OTULIN组IκBα蛋白降解、IκBα蛋白磷酸化以及NF-κp65蛋白核转位明显减少(P<0.01)。6.无论PM还是N9细胞中,OGD(+)CM组细胞OTULIN m RNA和蛋白含量均明显高于NC组和OGD(-)CM组。离体实验表明,LV-OTULIN可明显抑制OGD(+)CM刺激的小胶质细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白,抑制小胶质细胞NF-κB信号通路激活。结论1.局灶脑缺血/再灌注损伤诱导大鼠大脑皮质缺血旁组织内OTULIN表达增多;2.OTULIN过表达减轻局灶脑缺血/再灌注大鼠脑损伤;3.OTULIN过表达减轻局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血旁组织内小胶质细胞活化;4.OTULIN过表达可抑制NF-κB信号通路激活,减轻局灶脑缺血/再灌注大鼠脑内促炎因子释放;5.OTULIN过表达可抑制NF-κB信号通路激活,减轻小胶质细胞介导的神经炎症反应。第二部分电针上调OTULIN表达对局灶脑缺血/再灌注大鼠神经炎症的影响及机制研究目的1.探索电针对局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血旁组织内OTULIN表达的影响;2.探索OTULIN在局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血旁组织内的细胞定位类型;3.探索OTULIN在电针减轻局灶脑缺血/再灌注大鼠脑损伤中的可能作用;4.探讨OTULIN在电针减轻局灶脑缺血/再灌注大鼠神经炎症中的可能作用及机制;5.探讨电针上调神经元OTULIN表达对局灶脑缺血/再灌注大鼠神经元损伤的影响及可能机制。方法1.SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(t MCAO)组和电针组(t MCAO+EA)组,以再灌注后2 h-7 d为观察时间点,采用RT-q PCR和Western Blot检测各组大鼠大脑皮质缺血旁组织内OTULIN m RNA和蛋白质含量,免疫荧光分析OTULIN+细胞数量;2.大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(t MCAO)组和电针组(t MCAO+EA)组,免疫荧光观察各组大鼠大脑皮质缺血旁组织内OTULIN蛋白与神经元标记物Neu N、小胶质细胞标记物Iba-1及星形胶质细胞标记物GFAP共染情况;3.大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(t MCAO)组、模型+电针(t MCAO+EA)组、模型+电针+LV-Scramble(t MCAO+EA+LV-Scramble)组和模型+电针+LV-sh OTULIN(t MCAO+EA+LV-sh OTULIN)组。采用m NSS、inclined board test和rotarod test评价大鼠神经功能缺损程度,TTC染色测定脑梗死体积,免疫荧光检测大鼠大脑皮质缺血旁组织内Iba-1平均免疫荧光强度及不同状态的Iba-1+细胞占总Iba-1+细胞的比例、TUNEL+细胞比例、TUNEL+Neu N+细胞比例,以及NF-κB p65蛋白在Neu N+细胞内分布情况。ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量,Western Blot检测OTULIN蛋白含量、p-IκBα/IκBα、细胞胞核/胞浆NF-κB p65比例,Nissl染色观察各组大鼠大脑皮质缺血旁组织内神经元损伤情况。结果1.t MCAO组OTULIN m RNA和蛋白含量于再灌注后2 h迅速下降(P<0.05),后随再灌注时间延长而逐渐增多,t MCAO+EA组OTULIN m RNA和蛋白含量于再灌注后12 h至7 d均明显高于t MCAO组。再灌注后48 h,t MCAO组OTULIN+细胞数目明显多于Sham组(P<0.01),t MCAO+EA组OTULIN+细胞数目较t MCAO组进一步增多(P<0.01),各组OTULIN蛋白均主要位于细胞胞浆中。2.Sham组OTULIN蛋白主要位于神经元细胞内,t MCAO组OTULIN蛋白主要富集于Iba-1+细胞,其次位于Neu N+细胞。t MCAO+EA组OTULIN蛋白主要位于Neu N+细胞和Iba-1+细胞,各组均未在GFAP+细胞内发现OTULIN蛋白表达。3.再灌注后72 h,t MCAO+EA组大鼠神经功能较t MCAO组明显改善,表现为m NSS评分降低(P<0.05)、倾斜角度增大(P<0.05)和相对潜伏期延长(P<0.05),且脑梗死体积明显缩小(P<0.01)。沉默OTULIN后,电针的脑保护作用被明显削弱。4.再灌注后24 h和72 h,t MCAO+EA+LV-sh OTULIN组Iba-1平均免疫荧光强度明显高于t MCAO+EA组和t MCAO+EA+LV-Scramble组。再灌注后24 h,与t MCAO组相比,t MCAO+EA组半激活状态的小胶质细胞比例明显降低(P<0.001),静息状态的小胶质细胞比例明显升高(P<0.001)。沉默OTULIN后,与t MCAO+EA组相比,t MCAO+EA+LV-sh OTULIN组半激活状态的小胶质细胞比例明显升高(P<0.001),静息状态的小胶质细胞比例明显降低(P<0.001)。再灌注后72 h,与t MCAO组相比,t MCAO+EA组阿米巴状态的小胶质细胞比例明显下降(P<0.001),半激活状态的小胶质细胞比例明显升高(P<0.001),沉默OTULIN后,电针的该效应被明显抑制(P<0.001)。同时,与t MCAO+EA组相比,t MCAO+EA+LV-sh OTULIN组TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量明显增多,IκBα磷酸化以及NF-κB p65蛋白核转位增强(P<0.001)。5.抑制OTULIN表达后,电针明显改善缺血性脑卒中大鼠大脑皮质缺血旁组织内神经元细胞病理损伤的作用被抑制。此外,与t MCAO组相比,t MCAO+EA+LV-sh OTULIN组TUNEL+和TUNEL+Neu N+细胞比例降低(P<0.001),Neu N+细胞胞核内NF-κB p65蛋白明显增多,而胞浆NF-κB p65蛋白明显减少。结论1.电针上调局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血旁组织内OTULIN表达;2.OTULIN蛋白主要位于局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质缺血旁组织内小胶质细胞和神经元细胞;3.电针上调OTULIN表达减轻局灶脑缺血/再灌注大鼠脑损伤;4.电针上调OTULIN表达抑制NF-κB信号通路激活,减轻局灶脑缺血/再灌注大鼠神经炎症;5.电针可能通过上调神经元OTULIN表达减轻局灶脑缺血/再灌注大鼠神经元损伤。