碧根果青皮酚类物质的分离纯化及其抑菌机理研究

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碧根果(Carya illinoinensis(Wangenh.)K.Koch)又称薄壳山核桃。碧根果果实营养丰富,不饱和脂肪酸含量高,对人体健康有积极作用。碧根果青皮是碧根果加工过程中的主要副产物之一,全世界每年生产约42万吨,目前绝大多数青皮作为废弃物进行处理。有研究表明,碧根果青皮含有丰富的酚类物质,具有抗氧化、抑菌、消炎等作用。因此,进一步开发和利用碧根果青皮,对提高碧根果产业经济效益,减少资源浪费和环境污染有重要意义。本论文探究了不同干燥方式对碧根果青皮酚类物质的影响,利用大孔树脂联合聚酰胺对其进行了富集纯化,并对碧根果青皮酚类物质进行了初步鉴定,最后探究了其对细菌的抑制机理及其生物被膜的抑制活性。主要研究结果如下:1.不同干燥方法对碧根果青皮酚类物质的影响。分别采用冷冻干燥、真空干燥、热风干燥、传统干燥对碧根果青皮进行干燥处理,并对其酚类物质进行测定。结果表明,冷冻干燥能够最大程度的保留青皮中多酚和黄酮的含量。对不同干燥方式获得的碧根果青皮酚类物质进行抑菌实验,结果表明冷冻干燥获得的酚类物质具有最好的抑菌活性,其抑菌圈直径分别为20.4±0.6 mm(金黄色葡萄球菌)、18.2±0.5 mm(变形链球菌)、16.8±0.3 mm(铜绿假单胞菌)和14.9±0.3 mm(大肠杆菌)。2.碧根果青皮酚类物质的富集纯化及主要酚类物质鉴定。筛选出D101大孔树脂进行碧根果青皮酚类物质的富集,富集物的酚类含量为36.49±1.96%。再经过聚酰胺树脂二次纯化,其优化工艺为上样浓度6 mg/m L,上样流速1.0BV/h,洗脱流速1.0 BV/h,得到40%乙醇洗脱相(PPH-FPEEPA),酚类物质含量为88.71±2.84%。与粗提物相比,碧根果青皮酚类含量提高了5.6倍。通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF-MS)对其中的酚类物质进行分析,从碧根果青皮酚类物质纯化相中共鉴定出9种酚类物质,包括5种黄酮醇(槲皮素-3-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-桑布双糖苷、金丝桃苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷),1种黄酮类(木犀草素),1种异黄酮(染料木素)、2种原花青素类(原花青素二聚体A型和B型),其中槲皮素-3-O-桑布双糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、染料木素为首次在碧根果青皮中发现。3.碧根果青皮酚类物质对细菌抑制机理的研究。通过扫描电镜(SEM)观察细菌结构发现碧根果青皮酚类物质PPH-FPEEPA能破坏细胞壁与细胞膜;核酸泄漏测定以及流式细胞仪分析发现细菌细胞膜随着PPH-FPEEPA浓度的增加破坏程度逐渐增加。通过对β-半乳糖苷酶测定,表明PPH-FPEEPA增加了金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌细胞膜的通透性;NPN荧光强度显著增加,表明铜绿假单胞菌外膜通透性增加。通过对膜电位和膜流动性的测定,表明PPH-FPEEPA通过与细胞膜结合,会导致膜流动性降低和膜超极化现象。此外,细胞膜蛋白氨基酸残基荧光光谱表明Phe、Trp和Tyr残基荧光强度显著降低,并且随着PPH-FPEEPA浓度增大,红移明显,说明PPH-FPEEPA会导致膜蛋白构象发生改变。4.碧根果青皮酚类物质对细菌生物被膜的抑制研究。亚抑菌浓度PPH-FPEEPA能通过降低细菌界面疏水性及抑制细菌胞外多糖的产生有效抑制金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物被膜的形成。此外,通过相关性分析,PPHFPEEPA浓度与其对生物被膜的抑制率呈正相关,与培养时间呈负相关。扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察结果同样证明PPH-FPEEPA抑制生物被膜的效果随其浓度的增加而增强,说明PPH-FPEEPA的加入能显著破坏生物被膜,从而达到抑制细菌生物被膜的效果。
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