脑利钠肽(BNP)是一个活性多肽,由32个氨基酸构成,其功能域是由两个半胱氨酸形成二硫键构成的包含17个氨基酸的环状结构。人重组脑利钠肽(rhBNP)作为一种抗心力衰竭药物显示出了良好的应用前景。BNP与细胞膜上的利钠肽家族受体A(NPR-A)结合,可以催化三磷酸鸟苷(GTP)生成环磷酸鸟苷(cGMP),作为第二信使激活众多下游级联反应。脑利钠肽主要有两个降解途径,其中一个是作为体内蛋白酶的底物被降解,目前体内天然存在,能够降解BNP的酶中包括中性内肽酶(NEP)、二肽基肽酶4(DPP4)、胰蛋白酶和MEP1A。本实验旨在探究体外BNP结构的变化及对活性的影响。研究工作主要包括以下三个部分:1)建立了DTT还原BNP二硫键的方法,制备了稳定的还原态BNP样品,并对还原态BNP进行了结构确证。运用竞争性酶联免疫吸附法(Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA),对氧化及还原态BNP进行了活性检测。结果表明打开二硫键后的还原态BNP丧失生物学活性,证明BNP二硫键结构在其发挥生物学活性中的重要作用。2)分别用DPP4、NEP、MEP1A和胰蛋白酶四种体内天然存在的蛋白酶,在体外进行了氧化和还原态BNP酶切实验,确定了体外酶切条件,确证了酶切产物的特异性。其中DPP4和胰蛋白酶,获得了稳定的特异性酶切产物。该方法可以做为BNP肽图质量标准,应用于BNP产业化。酶切产物的体外活性研究结果表明,DPP4在酶切BNP后得到的3-32BNP,活性高于野生型1-32BNP。3)初步建立了双抗夹心ELISA检测血浆DPP4含量的方法,为快速、低成本检测血浆DPP4含量打下了基础。