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天然橡胶是一种类异戊二烯聚合物。据2019年统计,全球对天然橡胶的年需求量已达到3000万吨,且仍在稳步增长。巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Mull.Arg.)作为天然橡胶的主要来源,由于其易受病虫害危害且分布范围窄的缺点,导致橡胶产业面临着严峻挑战。杜仲橡胶是一种具有橡胶和塑料双重特性的反式聚异戊二烯,其开发的新型材料具有高绝缘性和耐酸碱腐蚀等优点。并且杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的适应性强,分布范围广、种植面积大,生产的反式胶质量好,是国际上公认的可以替代巴西橡胶树的胶源树种,是我国橡胶工业持续发展的重要保障。弄清楚杜仲橡胶合成的分子调控机理有利于使用分子育种技术提高杜仲中杜仲橡胶的含量。然而,杜仲橡胶生物合成机制非常复杂,相关的研究还非常有限。本研究利用高通量测序技术对高产胶杜仲品种“秦仲2号”和低产胶杜仲品种“小叶”的叶片进行转录组测序、sRNA测序及降解组测序和分析,从全基因组范围内分析miRNA与mRNA之间的调控网络。利用RLM-5’RACE技术和农杆菌介导的烟草瞬时共转化技术分别证实了n-eu-miR15与其靶基因GGPS6之间的切割和互作关系。并将n-eu-miR15的前体基因分别转化到拟南芥和杜仲中进行了功能研究。本研究为进一步阐释杜仲橡胶生物合成的分子调控机制提供理论基础,并为利用基因工程技术提高杜仲中杜仲橡胶含量提供新的思路。主要研究结果如下:1.筛选杜仲不同品种/基因型、不同发育时期、不同组织、低温胁迫、干旱胁迫和盐胁迫条件下的实时荧光定量PCR内参基因。利用geNorm、Normfinder、Bestkeeper、RefFinder软件分析11个常用的候选内参基因在上述实验条件下的稳定性,为各实验条件筛选适合的内参基因和最佳内参基因组合。结果如下:(1)不同品种/基因型,UBC和UBC E2是最稳定的内参基因,UBA80+UBC是最佳内参基因组合;(2)不同发育时期,HIS4和UBC是最稳定的内参基因,UBC+UBC E2是最佳内参基因组合;(3)不同组织,UBC和UBC E2是最稳定的内参基因,UBA52+UBA80是最佳内参基因组合;(4)低温胁迫下,TUB和UBC是最稳定的内参基因,TUB+UBC是最佳内参基因组合;(5)干旱胁迫下,UBA80和HIS4是最稳定的内参基因,HIS2B+UBC E2是最佳内参基因组合;(6)盐胁迫下,UBA80和HIS4是最稳定的内参基因,UBC E2+TUB是最佳内参基因组合。此外,用三个功能基因同时验证各试验条件下筛选出来的内参基因,结果表明本研究所筛选出的内参基因准确可靠。2.转录测序鉴定杜仲橡胶生物合成的关键基因。转录组测序共拼接到153241个转录本,进一步组装成82065个unigenes。比较转录组学分析,共鉴定到568个差异表达基因(HR vs LR),其中341个unigenes上调表达,227个unigenes下调表达。GO富集分析发现这些差异表达基因主要参与代谢过程、单一机体过程、细胞过程、细胞成分、催化活性和绑定等过程。通过KEGG富集分析,将125个unigenes富集到49个通路中,包括细胞过程、环境信息过程、遗传信息过程、代谢和有机体组成等。其中,代谢过程所包含的差异表达基因最多,有119个。富集到萜类物质合成(ko00900)的有3个差异表达基因(ACCT2、DXS2、GGPS6)。3.鉴定杜仲叶片中的miRNA。通过sRNA测序,共鉴定出221个miRNAs,包括68个已知miRNAs和153个新miRNAs。利用psRNATarget软件进行靶基因预测,221个miRNAs共预测到20815个靶基因,其中有779个miRNA-靶基因对被降解组测序验证。对靶基因进行GO富集分析,发现其主要参与单一机体过程、细胞过程的正向调节、单细胞生物过程、发育过程、多细胞生物过程、金属离子转运、应激响应等。通过KEGG注释,共有1866个靶基因被注释到107个通路中,其中17个靶基因被注释到杜仲橡胶生物合成通路,43个miRNAs参与调控这17个靶基因。4.杜仲转录组和sRNA测序数据关联分析鉴定杜仲橡胶生物合成的关键基因及对应的miRNA。对基因表达谱和miRNA表达谱联合分析,221个miRNAs中有31个差异表达miRNAs,包括4个已知miRNAs和27个新miRNAs。其中,有19个miRNAs在HR文库中上调表达,12个miRNAs下调表达。在所有靶基因中,有214个为差异表达基因;其中,37个差异表达基因是22个差异表达miRNAs的靶基因,形成了44个miRNA-靶基因对,包括19对正调控,25对负调控。其中,参与到杜仲橡胶生物合成过程中的有n-eu-miR15与其靶基因GGPS6(c133948.graph_c0)。5.揭示了n-eu-miR15的生物学功能。利用RLM-5’RACE技术验证了n-eu-miR15对其靶基因GGPS6的切割作用;并通过农杆菌介导的烟草瞬时共转化技术验证了n-eu-miR15与GGPS6之间的互作关系,进一步证明了n-eu-miR15对GGPS6的切割作用,并且能够降低GGPS6的表达量。克隆了n-eu-miR15的前体基因MIR15,并通过农杆菌介导的MIR15转化拟南芥及杜仲下胚轴。结果表明,MIR15在拟南芥中过表达将导致拟南芥中的聚异戊二烯含量降低;在杜仲中过表达MIR15将导致杜仲含胶细胞数目明显减少且体积缩小,说明n-eu-miR15对杜仲橡胶的生物合成起到强烈抑制作用。